Regulatio of actin cytoskeleton by TIS21 vi downregulating reactive oxygen species (ROS) in the doxorubicin-induced premature senescenc

Abstract

BTG2(B-cell translocation gene2)is a member of the BTG/Tob family of anti-proliferative genes and has been implicated in various cellular processes including cell cycle progression, differentiation and apoptosis. Cellular senescence is an irreversible arrest of proliferation, which is induced by replicative cell division (replicative senescence) or stress (stress induced premature senescence; SIPS). Cellular senescence is induced by DNA damage, telomere shortening or oncogene activation. During cellular senescence BTG2 is stabilized in response to telomere dysfunction. Doxorubicin is an effective anticancer drug that belongs to a class of anthracyclines and a commonly used inducer of DNA damage. Here, we show the role of BTG2 in doxorubicin induced senescence in human diploid fibroblast. We observed increase in SA-β-galstaining, change in cellular morphology, an increase in BTG2expression and ROS level in response to doxorubicin treatment along with F-actin distribution in HDF cells, suggesting doxorubicin induced senescence phenotypes. However, TIS21 over expression reduced the phenotypes characterized by the morphological change, SA-β-galstaining, F-actin re-distribution and ROS generations after doxorubicin treatment. The effect of TIS21 on the doxorubicin induced senescence phenotypes was further confirmed by knocking down of endogenous BTG2 expression. However, the underlying mechanism of BTG2 effect on stress induced senescence needs further studies.

일반적으로 세포노화(CellularSenescence)란 자연적으로 시간이 흐르며 세포 증식이 억제되어 이전의 모습으로 되돌릴 수 없는 현상을 지칭한다. 이러한 세포 노화는 자연노화(Replicative Senescence)와 조기노화(Premature senescence)로 크게 구분되며 조기노화는 여러 세포 외부의 인위적인 자극에 의해서 유도할 수 있다. 본 연구에서 사용한 유전자인 Human BTG2(B-celltranslocationgene2)는 APRO 상동 범위인 Box-A (Tyr49-Asn71)와 Box-B(Leu96-Glu115)를 가진 APRO (antiproliferative)단백질 집단에 속한다. BTG2와 상동유전자인 mouse에서 밝혀진 TIS21 (TPA induciblesequences21) 유전자는 12-O-tetradecanoyl phorbol-13-acetate (TPA)를 SW3T3 세포에 처리하여 얻어졌고, PC3 는 rat PC12세포에서 밝혀졌다. BTG2는 세포내의 전자 공동 조절자, 신경조직 분화에 관여하는 인자, 신경 상피세포를 분화시키며, 흉선세포의 특정 분화단계에 맞게 증식하는 매개자와 조혈모세포의 증식억제 조절자의 역할을 한다. 또한 SV40T 생쥐에서 흉선암, 신장세포암과 전립선암의 종양억제 유전자로서 기능을 하고 유방암 노화현상을 조절한다. 그리고 세포주기 조절자로서 세포를 정지시키거나 세포사멸을 유도하는 것으로 알려져 있다. 본 연구는 Human Fibroblast에 자연노화를 유도하였을 때 BTG2의 발현이 증가되어 있는 문헌을 바탕으로 조기노화를 유도하였을 때 BTG2의 발현 양상과 조절 기작을 규명하고자 하였다. 조기노화 유도 모델은 DNA 염기서열에 직접적으로 삽입 되어 α-helix 구조 변형으로 DNA damage를 일으키는 대표적인 anti-cancerdrug인 Doxorubicin을 저농도로 처리하여 유도하였다. 현재까지 Doxorubicin의 노화기전은 정확히 규명되지 않았고 Doxorubicin을 처리하여 정상 human HDF 세포의 조기노화현상에 anti-proliferative gene BTG2의 관련성을 확인하고자 하였다. HDF 세포에 Ad-TIS21으로 세포내에 과발현 시키고 doxorubicin으로 노화를 유도한 경우 doxorubicin에 의한 노화가 억제되는 현상을 관찰하였으며, 반대로 siBTG2를 사용하여 세포내의 BTG2발현을 억제시킨 경우에는 노화가 증가하는 현상을 여러 노화 표지들을 사용하여 확인하였다. 본 연구에서 주목한 점은 노화세포의 대표적인 표현형(phenotype)인 세포의 크기가 커지고 세포질이 퍼지는 현상과 및 세포가 가늘고 길어지는 현상도 같이 관찰 되었는데, 이는 세포에 여러 가지 stress가 있을 경우 Actin의 위치와 모양이 변화된다는 보고 및 노화된 세포에서 actin filament가 가늘어지고 끊어지는 현상이 일어난다는 보고를 통해 Actin filament와 노화와의 관련성에 주목할 수 있었다. HDF 세포에 TIS21이 단독으로 발현할 경우 actin filament의 변화는 정상 대조군과 비교하여 별 차이가 없었지만 doxorubicin으로 노화를 유도한 세포에서는 정상 대조군에 비해 TIS21이 과발현된 세포에서는 Actin filament의 위치가 변화하는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과로 유추해 볼 때 TIS21은 정상 HDF 세포에서 Doxorubicin에 의한 조기세포 노화의 감소가 actinfilament와 연관되어 어떤 기전을 통해 노화억제를 조절한다고 생각되며 이 결과를 바탕으로 BTG2와 세포 조기노화와의 연관성 및 분자생물학 기전을 알아보고자 하였다.