Regulation of mGluR7 trafficking by SUMOylatio in neurons

Abstract

Protein SUMOylation is a post-translationalmodification by which SmallUbiquitin-like MOdifier (SUMO) proteins are covalently linked to the lysine residues of target proteins via an enzymatic cascade. It has been reported that SUMOylation of synaptic proteins plays important regulatory roles in synapse formation, axonal mRNA transport, channel activity, and receptorendocytosis. The metabotropic glutamate receptor type 7 (mGluR7), a presynaptic G protein-coupled receptor modulates excitatoryneurotransmission and synaptic plasticity by inhibiting neurotransmitter release. mGluR7 at Lys889 has been proposed to be modified by SUMO proteins invitroassays, and a consensus motiffor SUMO conjugation is conserved in the C-terminus of mGluR7. However, a recent study has failed to demonstrate the SUMO conjugation of full-length mGluR7 in mammalian cells and neurons. Here we have explored whether mGluR7 is a target of SUMOylation. Using biochemical approaches coupled with confocal imaging, we find that mGluR7 at Lys889, the sole SUMOylation site on the C-terminus of mGluR7 is a target of SUMO conjugation both by SUMO-1and SUMO-2/3 in HEK293T cells. The SUMOylation of mGluR7 is prevented by SUMO-specific isopeptidase SENP-1. Furthermore, the SUMOylation of mGluR7mediated by SUMO-1 and SUMO-2/3 is identified in primary cortical neurons. Of particular interest, treatment of mGluR7 with an agonist,L-AP4 leads to a profound decrease of SUMO-1 conjugation of mGluR7, whereas there is no change of agonist-induced SUMO-2/3 conjugation of mGluR7. In addition, we find that mutation of mGluR7 at Lys889 to Arg markedly increases mGluR7 internalization in hippocampal neurons. Overexpression of SENP-1 leads to increased internalization of mGluR7, whereas SENP-1Cys603Ser, a catalytic inactive mutant has no effects, suggesting that endocytosis of mGluR7 is enhanced by reduced SUMO conjugation of mGluR7. Taken together, these data support a modelin which SUMOylation of mGluR7 at Lys889 for stable surface expression of mGluR7 in neurons.

수모화 (SUMOylation)반응은 단백질의 기능을 조절하여 생물체의 기능을 다양화시키는 전사 후 변형 (post-translationalmodification)의 한 종류로 수모(SUMO)단백질이 기질 단백질에 결합하여 수모화 반응이 일어난 기질 단백질의 기능을 변화시키는 역할을 한다. 시냅스에서 수모화 반응이 일어나게 되면 시냅스 형성, axonalmRNA 수송, 이온채널 활성도, 수용체의 세포내 유입이 조절된다. 시냅스에서 수모화 반응에 의해 수용체가 조절하여 시냅스를 조절한다는 보고가 많이 있지만 특히 최근에 흥분성 시냅스를 조절하는 수용체인 metabotropicglutamatereceptor 7 (mGluR7) 수용체의 수모화 반응에 대한 연구가 진행되고 있다. 이전 보고들에 의하면 mGluR7수용체의 수모화 반응은 mGluR7C-말단의 라이신 889잔기에서 일어난다고 밝혀졌다. 하지만 in vivo 상태에서 mGluR7 수용체의 수모화 반응이 일어나는 것의 여부는 아직 불분명한 상태이다. 따라서 본 연구에서는 full-length mGluR7수용체를 과발현시킨 HEK293T 세포에서 mGluR7 수용체의 수모화 반응이 일어나는지에 대한 여부를 확인하고 뉴런세포에서 mGluR7 수용체의 수모화 반응을 확인하고자 하였다. 먼저 full-lengthmGluR7 수용체의 수모화 반응을 확인하기 위해 HEK293T 세포에 수모 단백질과 full-lengthmGluR7 수용체를 같이 형질주입하여 면역침강법과 웨스턴 블로팅을 수행하였다. 그 결과 mGluR7 수용체의 수모화 반응이 일어나는 것을 발견하였다.이와 함께 mGluR7 수용체가 SUMO-1및 SUMO-2/3에 의해 수모화 반응이 일어나는 것을 확인하였다. 또한 신경세포와 대뇌조직에서 mGluR7 수용체의 수모화 반응이 일어나는지 확인하기 위해 면역침강법과 웨스턴 블로팅을 수행하여 mGluR7 수용체의 수모화 반응을 확인하였다. 또한, mGluR7 수용체의 수모화 반응의 역할을 조사하기 위하여 신경세포에 mGluR groupIII수용체의 agonist인 L-AP4를 처리하여 mGluR7 수용체의 수모화 반응의 변화를 확인하였다. 그 결과 mGluR7 수용체의 수모화 반응이 L-AP4에 의해 감소되는 것을 발견하였다. 이와 함께 신경세포에 mGluR7과 mGluR7K889R을 과발현시킨 다음 L-AP4를 처리하여 탈수모화 반응을 유도한 후, 공초점 형광현미경을 통하여 mGluR7 수용체의 trafficking의 변화를 관찰하였다.그 결과, L-AP4에 의해 mGluR7 수용체가 세포내로 유입되는 양이 증가하는 것을 발견하였다. 또한, mGluR7 수용체 수모화 반응이 mGluR7 수용체의 trafficking을 조절하는 인산화 반응과 관련이 있는지를 확인하기 위하여, mGluR7을 과발현시킨 HEK293T 세포에 PMA 약물을 이용해 인산화 반응을 활성화시킨 후 mGluR7 수용체의 수모화 반응의 변화를 조사하였다. 그 결과,mGluR7 수용체의 인산화 반응을 유도했을 때 mGluR7 수용체의 수모화 반응이 증가하는 것을 발견하여 mGluR7 수용체의 인산화 반응이 mGluR7 수용체의 수모화 반응을 유도하는 것을 관찰하였다. 이러한 결과로, mGluR7 수용체의 수모화 반응이 mGluR7 수용체의 trafficking을 조절하는 것을 확인하였다.