Management of cartilage deficiency by applying extracellular matrix membrane on bone marrow stimulation technique and evaluating the quality of repaired cartilage

Abstract

Articular cartilage is a resilient load-bearing tissue that forms the articulating surface of diarthrodial joints and provides low friction, lubrication, and wearless characteristics necessary for repetitive gliding motion. However, because articular cartilage has neither vascular nor lymphatic channel supply and hence difficult access to stem cells, its selfhealing potential is restricted. If left untreated, cartilage damage results in osteoarthritis (OA) and its endstage from, can only be managed by joint replacement surgery. We hereby provide means to repair cartilage using extracellular matrix (ECM) membrane on bone marrow stimulation (BMS) techic and development of a novel analytic method for detection of engineered cartilage. Chapter Ⅰ: BMS has been regarded as a first line procedure for repair of articular cartilage. However, repaired cartilage from BMS is known to be unlike that of hyaline cartilage and its inner endurance is not guaranteed. The reason presumably came from a shortage of cartilage forming cells in blood clots derived by BMS. In order to increase repairable cellularity, the feasibility of autologous bone marrow-derived buffy coat transplantation in repair of large full-thickness cartilage defects was investigated in this study. Rabbits were divided into four groups: the defect remained untreated as a negative control; performance of BMS only (BMS group); BMS followed by supplementation of autologous bone marrow buffy coat (Buffy coat group); transplantation of autologous osteochondral transplantation (AOTS) as a positive control. Repair of cartilage defects in the Buffy coat group in a rabbit model was more effective than BMS alone and similar to AOTS. Gross findings, histological analysis, histological scoring, immunohistochemistry, and chemical assay demonstrated that supplementation of autologous bone marrow buffy coat after BMS arthroplasty effectively repaired cartilage defects in a rabbit model, and was more effective than BMS arthroplasty alone. Supplementation of autologous bone marrow-derived buffy coat in cases of BMS could be a useful clinical protocol for cartilage repair. Chapter Ⅱ: The recombinant human transforming growth factor beta-3 (rhTGF-β3) is known as a key regulator of chondrogenesis of stem cells and cartilage formation. We have developed a novel drug delivery system that continuously releases rhTGF-β3 using an extracellular matrix (ECM) membrane fabricated from cultured porcine chondrocytes. We hypothesized that rhTGF-β3-loaded ECM membrane could significantly enhance cartilage regeneration, when it was applied on the osteochondral defect of rabbit articular cartilage treated with the bone marrow stimulation (BMS) technique. New Zealand white rabbits of 16 weeks old (an average weight of 3.0-3.5kg, n=78) were subjected to osteochondral defect on right knee joints and divided into four groups: The defect was (1) left untreated as a negative control (Control group), (2) covered with ECM membrane after BMS (Control-m), (3) treated with direct injection of rhTGF-β3, and covered with the ECM membrane after BMS (TGF-i) and (4) covered with rhTGF-β3-loaded ECM membrane after BMS (TGF-m). The results showed that repair of osteochondral defects was more efficient in the TGF-m group than the other groups including that with direct injection of rhTGF-β3 in gross findings, histological analysis, histological scoring and chemical assays for GAGs, collagen and DNA contents. We speculate that the sustained release of rhTGF-β3 using the ECM membrane after BMS could be a useful clinical protocol for cartilage repair. Chapter Ⅲ: In cartilage tissue engineering, it is very important to evaluate specifically and non-destructively the quality of engineered tissues in terms of matrix content and their three dimensional (3D) distribution. The objective of this study was to evaluate the feasibility of using microfocal computed tomography (μCT) with Hexabrix, a contrast agent, in examining the quality of engineered cartilage. Chondrocytes were isolated from the knee articular cartilage of 2- to 3-week-old rabbits. Cells at passage 2 (5.0 x 105/ml) were loaded dynamically on polyglycolic acid (PGA) scaffolds (2 mm in diameter and 2 mm in thickness), and cultivated in a chondrogenic defined medium for 7, 14, 21and 28 days in vitro. The engineered cartilages were incubated with undiluted Hexabrix 320 for 20 min and analyzed by μCT scanning. The scanning data were visualized by 2D and 3D images and quantified by counting the number of voxels. The results were validated by histological images of engineered cartilages by Safranin-O staining and proteoglycan content by biochemical analysis. The optimal threshold value for quantification was determined by regression analysis with the total contents of sulfated glycosaminoglycans (GAGs) from 14 individual samples. The biological effect of uCT scanning on the engineered cartilage was also examined for cell viability and total contents of sulfated GAGs and DNA. The 2D μCT image of an engineered cartilage was matching well with the histological image of corresponding section by Safranin-O staining. Quantitative data obtained by 3D μCT images of 14 engineered cartilages showed a strong correlation with sulfated GAGs contents obtained by biochemical analysis (R2=0.883, P<0.001). Repeated exposure of engineered cartilages to Hexabrix 320 and μCT scanning did not affect significantly cell viability, total DNA content and total sulfated GAGs content. μCT imaging using Hexabrix 320 provides high spatial resolution and sensitivity to assess sulfated GAGs content and 3D distribution in engineering cartilage. Therefore it could be a valuable tool to evaluate the quality of engineered cartilage and greatly benefit its developmental process.

최근 들어 조직공학적 방법으로 연골손상을 치료하려는 연구가 활발히 진행되고 있다. 관절연골은 탄성이 높아 고무 같으므로 가해진 힘에 대한 완충능력이나 에너지 흡수능력이 크다. 활막이 덮고 있는 관절연골의 마찰계수는 매우 낮아 마찰이 거의 없이 움 직 일수 있다. 하지만 관절연골은 자아재생능력이 낮은 약점이 있다. 그 이유는 명확히 알려지지는 않았지만 추측하건대 연골은 혈관과 임파관이 없으므로 줄기세포가 없다. 때문에 손상된 연골을 치유해 주지 않으면 주위의 정상연골까지 악영향을 줘서 최종적으로 퇴행성관절염으로 발전한다. 아래의 연구들에서는 연골재생을 위하여 다양한 방법과 재료를 이용하였고 게다가 퇴행성관절염의 초기 진단 방법을 확립하였다. Chapter Ⅰ: 골수자극술을 시행한 후 자가골수유래 buffy coat를 연골결손부위에 추가로 주입하여 buffy coat의 연골재생증진효과를 확인한다. 실험동물은 뉴질랜드 화이트 토끼를 사용했고 실험군은 아래와 같이 4군으로 나누었다. 대퇴골 활차부위에 직경이 5 mm, 깊이가 2 mm인 연골손상만 제작한 군을 음성대조군으로, 손상부위에 직경 5 mm 인 드릴날과 17G 바늘로 골수자극술을 시행한 군, 골수자극술 후 자가골수유래 buffy coat를 추가 주입한 군, 그리고 자가연골하골 이식군을 양성 대조군으로 했다. 골수자극술 후 형성된 혈병과 주입한 buffy coat의 유실을 방지하기 위해 그룹 1, 2 와 3에는 얇은 세포외기질막으로 손상부위를 덮어주었다. 결과를 살펴보면 육안과 조직학적 염색상 1, 2 그룹에서는 섬유연골조직이 많이 섞여 있는 반면에 3, 4 그룹에서는 대부분 초자연골로 재생된 것을 관찰 할 수 있었다. 면역조직화학 염색상 3, 4 그룹에서는 1, 2 그룹보다 제2형 교원질이 현저히 많이 발현된 것을 관찰할 수 있었다. ICRS 조직학적 평점에서도 3, 4 그룹은 1, 2 그룹보다 높았으며 통계학적으로도 유의한 차이를 보였다. 본 실험을 통하여 골수자극술 후 자가골수유래 buffy coat를 추가 주입하고 얇은 세포외기질막을 덮어주므로 연골재생효과를 증진할 수 있음을 확인할 수 있었다. 이러한 연구 결과는 자가골수유래 buffy coat를 주입하여 보다 많은 중간엽줄기세포들 (MSCs)을 제공함과 동시에 그 분화능력을 향상시키고, 세포외기질막을 덮어줌으로서 주입된 자가골수유래 buffy coat와 형성된 혈병이 관절강 내로의 유실되는 것을 방지하여 연골재생 효과를 증진한 것이 원인으로 판단된다. 결론적으로 연골재생에 있어 골수자극술 후 자가골수유래 buffy coat을 주입하는 술법은 임상에서도 유용한 연골재생 치료법이 될 수 있을 것으로 기대된다. Chapter Ⅱ: rhTGF-β3 는 줄기세포가 연골세포로의 전환과 연골의 형성에 있어서 핵심적인 성장인자 이다. 본 연구는 rhTGF-β3 를 지속적으로 서서히 방출할 수 있는 세포외기질로 형성된 생체재료막, 새로운 약물 전달 시스템의 연골재생 효과를 검증한다. 실험동물은 뉴질랜드 화이트 토끼를 사용했고 실험군은 아래와 같이 4군으로 나누었다. 대퇴골 활차부위에 직경이 5mm, 깊이가 1.5mm인 연골손상만 제작한 군을 음성대조군으로, 손상부위에 직경 1mm 송곳으로 골수자극술을 시행하고 rhTGF-β3 들어있지 않은 생체재료막을 덮어 준 군, 골수자극술 후 rhTGF-β3 를 관절낭에 주입한 군, 그리고 골수자극술 후 rhTGF-β3 가 들어 있는 생체재료막을 덮어 주었다. 결과를 살펴보면 rhTGF-β3 가 들어있는 생체재료막을 덮어준 군이 생화학적 분석과 조직학적 분석에서 모두 다른 군보다 좋은 결과를 보였다. 그러므로 우리는 rhTGF-β3 를 지속적으로 서서히 방출할 수 있는 생체재료막은 연골재생에 있어서 아주 훌륭한 생체재료가 될 것으로 사료된다. Chapter Ⅲ: Engineered cartilage는 연골손상을 치유함에 있어서 아주 중요한 역할을 한다. 본 연구는 Engineered cartilage에 손상을 주지 않고 μCT를 이용하여 GAG의 분포와 양을 측정하는 것이다. Hexabix의 incubation time을 최적화 하기 위하여 4주토끼 연골에서 cartilage 조각을 확보하였고, 나머지 부분에서는 연골세포를 분리하여 배양하였다. Engineering cartialge를 제조하기 위하여 연골세포를 계대배양 두번째에서 직경 2mm, 두께 2mm PGA 지지체에 접종하여 분화시키면서 μCT로 각 시기별로 측정하였고 μCT 조건은 40kv, 250 mA에서 해상도는 9um 로 한시간 정도 촬영을 진행하였다. GAG의 분포를 3D 상에서 관찰한 다음 Biochemical assay 을 진행하였다. 3D 상에서 얻은 GAG의 voxels number 와 biochemical assay을 통하여 얻은 GAG의 양이 상관관계 분석결과 P=0.000 으로 0.01 수준에서 유의한 것을 관찰할 수 있었다. R의 제곱값은 0.8883로 종속변수(Y)의 분산이 독립변수(X)의 분산에 의해 88% 이상이 설명됨을 알 수 있다. Engineering cartilage 연구함에 있어서 μCT를 이용하면 GAG양과 분포를 손쉽게 정확히 측정하고 관찰할 수 있다. 때문에 앞으로 μCT는 engineering cartilage의 발전에 높은 기여를 할 것이다.