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Development and characterization of recombinant human autoantibody using cDNA made from peripheral blood mononuclear cells of patients with bronchial asthma

DC Field Value Language
dc.contributor.author조, 수미-
dc.date.accessioned2015-10-28T01:08:37Z-
dc.date.available2015-10-28T01:08:37Z-
dc.date.issued2015-
dc.identifier.urihttp://repository.ajou.ac.kr/handle/201003/11832-
dc.language.isoko-
dc.titleDevelopment and characterization of recombinant human autoantibody using cDNA made from peripheral blood mononuclear cells of patients with bronchial asthma-
dc.title.alternative기관지 천식 환자의 말초혈액 단핵구 세포로부터 분리한 유전자를 이용한 재조합 인간 자가항체 개발 및 기능 검증-
dc.typeThesis-
dc.identifier.urlhttp://dcoll.ajou.ac.kr:9080/dcollection/jsp/common/DcLoOrgPer.jsp?sItemId=000000018915-
dc.subject.keyword비알레르기성 천식-
dc.subject.keyword자가면역기전-
dc.subject.keywordcytokeratin 18-
dc.subject.keywordphage display-
dc.subject.keyword자가항체-
dc.subject.keywordsingle-chain variable fragment(scFv)-
dc.subject.keywordlgG-
dc.description.tableOfContents국문요약 ⅰ

차례 ⅲ

그림차례 vi

Ⅰ. 서론 1

Ⅱ. 재료 및 방법 3

A. 대상 환자의 선별 및 채혈 3

1. 대상 환자 및 비알레르기성 천식의 임상적인 중증도 분류 3

B. 비알레르기성 천식 환자들의 말초혈액으로부터 total RNA 추출 3

1. 말초혈액 단핵구 세포 (peripheral blood mononuclear cell, PBMC) 분리 3

2. Total RNA 추출 4

3. mRNA 분리 4

C. Polymerase chain reaction (PCR)을 이용한 cytokeratin 18 (CK-18) 단백질에 대한 인간 single-chain variable fragment (scFv) 항체 라이브러리의 구축 5

1. cDNA 합성과 중합효소 연쇄반응 (PCR) 5

2. scFv의 heavy chain과 light chain 합성 5

3. Overlapping PCR을 통한 인간재조합 scFv의 제작 5

4. Ligation 6

5. Library transformation 6

D. CK-18 단백질에 결합하는 scFv항체의 선별 분리 7

1. Panning 7

2. Phage ELISA를 통한 CK-18 단백질 특이 scFv의 선별 8

3. scFv정제를 위한 subcloning 9

4. scFv 단백질 정제 10

E. 선별된 scFv항체의 CK-18 단백질에 대한 반응 평가 11

1. Sodiumdodecylsµlfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) 와 immunoblot 11

2. 정제된 scFv항체들을 이용한 ELISA 11

F. 인간 유전자 재조합 단클론 IgG 자가항체의 제작 및 정제 12

1. IgG 자가항체의 제작 12

2. IgG 자가항체 생산을 위한 세포배양 12

3. Protein A column을 이용한 IgG 자가항체의 정제 13

G. IgG 자가항체의 CK-18 단백질에 대한 반응 평가 13

1. IgG 자가항체를 이용한 항원 반응특성의 ELISA 13

2. Immunoblot 분석 14

3. Immunofluorescence analysis 14

4. Flow cytometry 분석 15

H. IgG 자가항체의 세포독성 평가 및 세포사멸 기전 관찰 15

1. 3- (4,5-dimethylthiazol-2yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT) assay 15

2. 사람 보체 첨가시 자가항체에 의한 세포독성의 변화 분석 16

3. Annexin V-FITC / propidium iodide (PI) assay를 이용한 세포사멸기전 분석 16

Ⅲ. 결과 18

A. 비알레르기성 천식 환자들의 말초혈액단핵구 (PBMC)로 부터 추출한 total RNA 18

B. 인간 유전자 재조합 단클론 scFv자가항체들과 인간 유전자 재조합 단클론 IgG자가항체들의 정제 및 SDS-PAGE 18

C. Immunoblot을 통한 CK-18 단백질에 대한 단클론 IgG자가항체의 반응 확인 19

D. ELISA를 이용한 CK-18 단백질에 대한 양성 단클론 scFv자가항체와 양성 단클론 IgG 자가항체의 반응 확인 20

E. Immunofluorescence 분석을 통한 IgG 자가항체의 A549 세포에 대한 반응 23

F. Flow cytometry를 이용한 IgG 자가항체의 A549 세포에 대한 항원반응 측정 24

G. A549세포에 대한 인간 유전자 재조합 단클론 IgG 자가항체의 세포 독성 측정 25

H. Flow cytometry를 통한 세포독성기전 분석 결과 29

Ⅳ. 고찰 31

Ⅴ. 결론 37

참고문헌 38

ABSTRACT 41
-
dc.description.degreeMaster-
dc.contributor.affiliatedAuthor조, 수미-
dc.date.awarded2015-
dc.type.localTheses-
dc.citation.date2015-
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