Cited 0 times in Scipus Cited Count

Production and characterization of monoclonal antibodies against cathepsin B and cathepsin B-Like proteins of Naegleria fowleri

DC Field Value Language
dc.contributor.author성, 기상-
dc.date.accessioned2016-11-29T06:06:42Z-
dc.date.available2016-11-29T06:06:42Z-
dc.date.issued2016-
dc.identifier.urihttp://repository.ajou.ac.kr/handle/201003/13043-
dc.description.abstract파울러자유아메바(Naegleria fowleri)는 원발성 아메바성 수막뇌염(primary amoebic meningoencephalitis; PAM)을 일으키는 병원체이다. 파울러자유아메바의 사람이나 실험 동물에 감염은 아메바가 오염된 물에서 물놀이 혹은 수중활동을 할 때 비강내로 아메바 영양형이 유입될 때 일어난다. 파울러자유아메바의 병인기전으로는 숙주세포와 접촉하여 사멸에 이르게 하는 접촉성 병인기작과 여러가지 단백분해효소를 분비하여 숙주세포에 영향을 주는 비접촉성 병인기작으로 알려져 있다. 파울러자유아메바의 시스테인 단백분해효소계열인 Cathepsin B (NfCPB) 및 Cathepsin B-Like (NfCPB-L) 단백질이 클로닝 되었고, 이들의 유전자 크기는 각각 1,038 bp (345개 아미노산) 및 939 bp (313개 아미노산)이다. 재조합 NfCPB와 NfCPB-L 단백질은 각각 38.4 kDa과 34 kDa의 분자량을 갖고 있으며, 숙주의 조직침투, 면역회피와 영양분흡수에 관련이 있다고 보고되었다. 본 연구는 파울러자유아메바에서 NfCPB와 NfCPB-L 단백질의 분자 면역학적 특성을 관찰하기 위하여 단클론항체를 생산하고자 하였다. 먼저 재조합 NfCPB 및 NfCPB-L 단백질을 얻은 후 마우스에 2주 간격으로 3번 면역시키고, 혈청을 얻어서 ELISA를 통해 항체가(titre)가 높아진 것을 확인하였다. 면역된 마우스의 비장(spleen)을 적출하여 비장세포들을 얻고 myeloma cell line인 F/0 세포들과 세포융합기술(cell fusion)을 통해 잡종세포(hybridoma cell)를 얻었다. 항체가가 높은 클론을 선택하여 제한개수희석법(limiting dilution)을 통하여 단클론세포주(monoclone)를 얻었다. 항-NfCPB 단클론항체를 분비하는 단클론세포주 7개를 얻었고, 항-NfCPB-L 단클론항체를 분비하는 단클론세포주 3개를 얻었다. 이 중 항체가가 높은 단클론 세포주를 각각 한 개씩 즉, 2C9 (항-NfCPB)과 1C8 (항-NfCPB-L)선택하여 마우스의 복강에 주입하여 복수를 얻었고 정제하여 대량의 단클론항체를 얻었다. 각 항원에 대한 western blot을 시행한 결과, 2C9 단클론항체는 파울러자유아메바의 전체세포 추출물(lysate)과 재조합 NfCPB 단백질에서 각각 28 kDa, 38.4 kDa에서 반응하였으며, 1C8 단클론항체는 파울러자유아메바의 전체세포추출물과 재조합 NfCPB-L 단백질에서 각각 24 kDa과 34 kDa에서 반응하였다. 또한, 종 특이성(species-specific)을 확인하기 위하여 파울러자유아메바(N. fowleri), 그루버자유아메바(N. gruberi), 카스텔란가시아메바 (Acanth-amoeba castellanii), 대식가시아메바(A. polyphaga)의 전체세포 추출물과 2C9과 1C8을 이용하여 각각 western blot을 시행한 결과, 파울러자유아메바 이외의 다른 종의 아메바에서는 반응하지 않았다. Immunocytochemistry assay를 통해 파울러자유아메바 세포내에서 NfCPB와 NfCPB-L 발현위치를 관찰한 결과, 대체로 세포질 전체에서 분포하고 있었으며 특히, 위족(psudophodia)과 food-cup에 많이 분포하고 있었다. 본 연구결과, 2C9와 1C8 단클론항체는 파울러자유아메바를 면역학적으로 연구하는데 유용하게 사용될 것으로 생각된다.-
dc.description.tableofcontentsI. 서론 1

1) 파울러자유아메바(Naegleria fowleri) 1

2) 원발성 아메바성 수막뇌염(PAM) 1

3) 파울러자유아메바의 병인기전 2

4) 시스테인 단백분해효소(Cysteine protease) 4

5) NfCPB 및 NfCPB-L 단백질 4

6) 연구의 목적 5



II. 재료 및 방법 6

1) 자유아메바의 배양 및 전체추출물 준비 6

2) 재조합 NfCPB와 NfCPB-L 단백질 생산 6

3) 재조합 NfCPB와 NfCPB-L 단백질의 마우스 면역 7

4) 효소면역측정법(ELISA) 7

5) 세포융합(cell fusion) 8

A. 마우스의 비장세포준비 8

B. Myeloma세포의 배양 9

C. 세포융합(cell fusion) 9

6) 단클론항체를 생산하는 세포군 선택 10

7) 단클론항체의 대량생산 및 정제 10

8) 단클론항체의 isotyping 11

9) 항원성 검정을 위한 SDS-PAGE 와 Western blot 시행 11

10) Immunocytochemistry 시행 12



III. 결과 13

1) 재조합 NfCPB와 NfCPB-L 단백질 생산 13

2) 재조합 NfCPB와 NfCPB-L단백질에 대한 단글론항체의 생산 15

A. 재조합 NfCPB와 NfCPB-L 단백질의 마우스 면역 15

B. 잡종세포주에서 항-NfCPB 항체와 항-NfCPB-L 항체 분비확인 17

C. 단클론세포주에서 항-NfCPB 항체와 항-NfCPB-L 항체 분비확인 19

3) 항-NfCPB 단클론항체와 항-NfCPB-L 단클론항체의 isotype 21

4) 2C9(항-NfCPB)와 1C8(항-NfCPB-L) 단클론항체의 항원성 23

5) 2C9(항-NfCPB)와 1C8(항-NfCPB-L) 단클론항체의 종특이성 25

6) 2C9(항-NfCPB)와 1C8(항-NfCPB-L) 단클론항체의 Immunocytochemistry assay 결과 27



IV. 고찰 29

V. 결론 33

참고문헌 34

ABSTRACT 38
-
dc.language.isoko-
dc.titleProduction and characterization of monoclonal antibodies against cathepsin B and cathepsin B-Like proteins of Naegleria fowleri-
dc.title.alternative파울러자유아메바 Cathepsin B 및 Cathepsin B-Like 단백질에 대한 단클론항체의 생산과 특성규명-
dc.typeThesis-
dc.identifier.urlhttp://dcoll.ajou.ac.kr:9080/dcollection/jsp/common/DcLoOrgPer.jsp?sItemId=000000022891-
dc.subject.keyword파울러자유아메바-
dc.subject.keyword단클론항체-
dc.subject.keywordCathepsin B 단백질-
dc.subject.keywordCathepsin B-Like 단백질-
dc.description.degreeMaster-
dc.contributor.department대학원 의생명과학과-
dc.contributor.affiliatedAuthor성, 기상-
dc.date.awarded2016-
dc.type.localTheses-
dc.citation.date2016-
dc.embargo.liftdate9999-12-31-
dc.embargo.terms9999-12-31-
Appears in Collections:
Theses > Graduate School of Biomedical Sciences > Master
Files in This Item:
There are no files associated with this item.

qrcode

해당 아이템을 이메일로 공유하기 원하시면 인증을 거치시기 바랍니다.

Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.

Browse