Effects of Vitamin D on Expression of Toll-like Receptors of Monocytes from Patients with Behcet's Disease

Abstract

PURPOSE: Behcet’s disease (BD) is a chronic, relapsing, systemic vasculitis of unknown etiology. Although the exact mechanisms of the increased inflammatory response is not yet clear, infectious agents and immunological cross-reaction with the heat-shock proteins (HSP) are considered to play roles in the pathogenesis. Toll-like receptors (TLRs) are involved in the initiation of innate immune response in several immune mediated inflammatory disease including BD by sensing the various microorganisms and triggering the signalling pathways, causing release of cytokines. Recent studies have noticed the immunomodulatory effect of vitamin D3 through down-regulation of TLR expression in human monocytes. To understand the role of vitamin D affecting innate immunity in BD, we focused on the association between the serum vitamin D concentration and the TLR expression in BD. MATERIALS AND METHODS: Serum 25-hydroxyvitamin D levels were measured in the patients with BD, psoriasis and healthy controls. The expression of CD16, TLR 2 and TLR 4 on blood monocytes was detected by flow cytometric analysis and semiquantitative RT-PCR among those groups. Then we correlated the values of serum 25-hydroxyvitamin D levels with the expression of TLRs and the clinical indicators of disease severity (ESR, CRP) among patients and control groups. Then, to assess the influence of Vitamin D on expression and function of TLRs, human monocytes were treated with increasing concentrations of 1,25(OH)2D3 in vitro . RESULTS: We found a trend toward lower 25-hydroxyvitamin D levels in active BD patients compared to controls. The monocytes of active BD patients showed higher expression of TLR2, TLR4 with increased proportion of CD16+ cells compared to the control groups. Interestingly the 25-hydroxyvitamin D levels were inversely correlated with the expression of TLR2, TLR4 and clinical indicators. In vitro study, 1,25(OH)2D3 suppressed the expression of TLR2, TLR4 protein and mRNA in human monocytes in a dose-dependent manner. TNF-α synthesis upon LPS, LTA and HSP60 stimulation was also decreased in 1,25(OH)2D3 treated monocytes in concordance with TLR2, TLR4 down-regulation. And the marked increase of TNF-α response to TLR2, TLR4 ligands was found in active BD monocytes when compared to normal, which was correlated with the higher TLR2, TLR4 expression. CONCLUSION: We found lower serum 25(OH)D levels among active BD patients compared to controls. These results suggest vitamin D deficiency as a possible risk factor for active BD. And treatment of vitamin D deficiency will have a positive impact on immune health. BD patients are known to be rather susceptible to infectious agents which are recognized by TLRs, and HSP60 induced immune-activation is considered as an endogenous “danger signal” in the pathogenesis of BD. Our results could strengthen the notion about immunomodulatory effects of vitamin D to innate immunity-mediated inflammation in BD through down-regulation of TLR2, TLR4 on monocytes.

연구 목적: 베체트병은 점막 및 피부, 눈, 심장, 혈관, 신장, 위장 그리고 신경이 침범될 수 있는 임상적 특징을 가지는 만성, 재발성의 전신 질환이다. 현재까지 베체트병에서 보이는 지속적인 염증 반응의 정확한 원인 기전은 밝혀져 있지 않으나 다양한 감염원과 체내의 열 충격 단백 (heat shock protein) 과의 면역 교차 반응이 발병에 중요한 역할을 담당할 것으로 보여진다. Toll-like receptor (TLR)는 박테리아, 바이러스 등의 외부 감염원의 pathogen-associated molecular pattern 을 빠르게 인지하여 체내에서 자연 면역 (innate immunity) 반응을 유도하는 세포막 유형 인지 수용체로, TLR에 의해 유도되는 proinflammatory cytokine 들의 과발현은 자가 면역 질환이나 만성 염증성 질환의 발병, 유지에 영향을 미칠 수 있다는 근거들이 보고된 바 있다. 최근에 활성형 비타민 D, 1,25(OH)2D3 (calcitriol)가 사람의 단핵구에서 TLR의 발현을 감소시켜 면역 조절 기능을 담당한다는 사실이 밝혀졌고, 자가 면역 질환의 여러 동물 연구에서 비타민 D의 투여 후 증상이 호전, 예방된 사례 등이 발표된 바 있어 비타민 D가 자가 면역 질환의 조절 가능한 외부인자로서 역할을 하고 있음이 제시되고 있다. 따라서 본 연구에서는 베체트병 환자 혈청의 vitamin D level과 TLR 발현 정도를 측정하고 이들의 correlation을 통해 vitamin D 의 자연 면역 (innate immunity)에 대한 조절 작용을 알아보고, 단핵구 세포 배양을 통해 이를 실험적으로 확인해 보고자 하였다. 연구 방법: 41명의 베체트병 환자군과 대조군으로 질환 대조군인 19명의 건선 대조군, 15명의 정상 대조군을 선정하여 혈청 25-hydroxyvitamin D 양을 측정하고, 혈액으로부터 분리된 단핵구의 CD16, TLR2, TLR4 발현 정도를 flow cytometric analysis와 semiquantitative RT-PCR 을 이용하여 측정하였다. 또한 TLR 발현과 ESR, CRP와 같은 질병 활성도와 혈청 내 hydroxyvitamin D 양의 관련성을 비교하였다. 그리고 THP-1 세포주, 정상인 단핵구, 베체트병 환자의 단핵구를 세포 배양한 후 1,25(OH)2D3 양을 달리하여 처리한 후 TLR2, TLR4의 발현, cytokine 양의 변화 등을 측정하였다. 연구 결과: 활동성 베체트병 환자군의 혈청 내 25-hydroxyvitamin D 양은 정상과 비교하여 낮은 경향을 보였다. 활동성 베체트병 환자군의 단핵구 TLR2, TLR4의 발현은 flow cytometric analysis와 RT-PCR에서 모두 대조군에 비해 통계학적으로 유의한 증가를 보였고, 베체트병 환자군에서 혈청 25-hydroxyvitamin D과 TLR2, TLR4의 발현 정도, 질병 활성도는 유의한 역비례 관계를 보였다. 단핵구 배양 시 1,25(OH)2D3 농도를 달리하여 처리한 결과 비타민 D가 농도에 비례하여 TLR2, TLR4 의 발현이 억제되었고, TLR2, TLR4 ligand 로 자극 후 TNF-α 양의 변화 또한 비타민 D 농도가 증가함에 따라 감소하는 경향을 보였다. 또한 같은 조건 하에서 TLR2, TLR4 ligand 로 정상인의 단핵구와 베체트 환자의 단핵구를 각각 자극했을 때 TNF-α의 양이 베체트 환자군에서 정상인 보다 유의하게 증가하는 결과를 볼 수 있었다. 결론: 본 연구 결과는 베체트병 환자군에서 혈청 비타민 D 양이 감소해 있음을 확인함으로써 비타민 D의 결핍이 활성 베체트의 위험 인자가 될 수 있음을 시사하였다. 또한 베체트병과 TLR 발현의 관련성을 통해 비타민 D가 베체트병 환자 단핵구의 TLR 발현, 기능을 억제함으로써 자연 면역으로부터 유도되는 만성 염증 과정에 대한 면역 조절 기능을 가짐을 보여주었다.