The Intracellular Changes and the Localization of Core particles by Hepatitis B Virus P Protein-Deficient Mutant

Abstract

PURPOSE: Hepatitis B virus (HBV) core particles move to ER or recycle back to the nucleus. This moving mechanism is thought to be important in HBV replication and HBV life cycles. P protein-deficient mutant can form core particles in the absence of P protein and pregenomic RNA (pgRNA). In this study, the intracellular changes of P protein-deficient mutant expressing stable cells and the localization of P protein-deficient mutant core particles were observed. MATERIALS & METHODS: HBV replicating and non-replicating stable cells had been established in HuH7 hepatoma cell lines. Using Northern blot and Southern blot analyses, HBV transcription and replication were examined in HBV replicating and non-replicating stable cells. Distribution of intracellular organelles was examined by immunofluorescene assay. Mitochondria were stained using Mito-Tracker. Core particles were visualized using anti-HBc antibody. Microtubules, vimentin, nuclear pore complex (NPC) were visualized using mouse anti-tubulin, mouse anti-vimentin, and mouse anti-NPC antibody, respectively. RESULTS: P-deficient mutant core particles co-localized with microtubule, NPC, and vimentin, like HBV wild type (wt) core particles. Core particles of priming- and reverse transcriptase-deficient mutants that only consist of immature core particles, were not co-localized with microtubule, NPC, and vimentin. The mitochondria of P-deficient mutant expressing stable cells aggregated into peri-nuclear region like those of HBV wt expressing stable cells. CONCLUSION: These results indicated that P protein-deficient mutant core particles act like HBV wt core particles, suggesting that P protein-deficient mutant and mature core particles might share similar properties.

목적: B형 간염 바이러스의 core 입자는 소포체로 이동하거나 핵으로 다시 들어간다. 이러한 이동 메카니즘은 B형 간염 바이러스의 복제와 생활사에 중요하게 작용할 것이라고 생각된다. 복제가 불가능한 다양한 변이주 중 DNA 중합효소가 없는 B형 간염 바이러스 변이주는 DNA 중합효소와 pgRNA가 없는 core 입자를 형성한다. 이 연구에서는 DNA 중합효소가 없는 변이주를 발현하는 세포의 세포내 변화와 DNA중합효소가 없는 변이주 core 입자의 세포내 위치를 관찰하였다. 재료 및 방법: 간암세포에서 확립된 B형 간염 바이러스가 증식하는 세포와 증식하지 못하는 stable세포를 이용하였다. Northern blot 과 Southern blot 분석에 의해서 B형 간염 바이러스의 전사와 복제를 확인하였다. 면역형광염색법 및 confocal 현미경에 의해서 세포 내 소기관의 분포를 관찰하였다. 미토콘드리아는 미토콘드리아에 특이적으로 염색되는 형광물질인 MitoTracker로 관찰하였다. 미세소관은 tubulin 항체, vimentin은 vimentin 항체, 핵공은 NPC 항체를 사용하여 관찰하였다. 또한 B형 간염 바이러스 core 입자는 core 항체를 이용하여서 관찰하였다. 결과: DNA 중합효소가 없는 B형 간염 바이러스 변이주가 발현하는 core 미세입자는 B형 간염 바이러스가 증식하는 세포의 core 입자와 마찬가지로 미세소관, 핵공, vimentin의 일부가 같이 위치하는 것을 관찰하였다. B형 간염 바이러스가 증식가능 하지 못하는 변이주가 만드는 미성숙한 core 입자는 미세소관, 핵공, vimentin과 세포내에서 같이 위치하지 않은 것으로 관찰되었다. 또한 DNA 중합효소가 없는 변이주를 발현하는 세포의 미토콘드리아 역시 B형 간염 바이러스가 증식하는 세포의 미토콘드리아처럼 핵 주변으로 응집되는 것을 알 수 있었다. 결론: 이상의 결과는 DNA 중합효소가 없는 변이주가 발현하는 core 입자는 B형 간염 바이러스가 발현하는 세포의 core 미세 입자와 비슷하게 행동하는 것으로 관찰되었다. 따라서, DNA 중합효소가 없는 변이주의 core 입자가 성숙한 core 입자와 비슷한 성질을 가질 것이라고 생각된다.