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Initial Stages of Hepatitis B Virus Replication

DC Field Value Language
dc.contributor.advisor김, 경민-
dc.contributor.author김, 희영-
dc.date.accessioned2011-01-27T05:44:06Z-
dc.date.available2011-01-27T05:44:06Z-
dc.date.issued2005-
dc.identifier.urihttp://repository.ajou.ac.kr/handle/201003/1349-
dc.description.abstractPART 1 Intracellular Trafficking of HBV Core Particle in Various Stage of DNA Replication Inside of hepatitis B virus (HBV) core particle, pgRNA is reverse transcribed by HBV DNA polymerase into minus-strand DNA and pregenomic RNA (pgRNA) is degraded concomitantly by RNase H activity of DNA polymerase. Then, plus-strand DNA is synthesized to double-stranded relaxed circular DNA. Through this HBV DNA replication, immature core particle becomes mature core particle. This mature core particle can either be transported back into nucleus to amplify the intracellular viral genome pool, or be enveloped at intracellular membrane to be secreted as a mature virion. In this study, intracellular trafficking of HBV core particles was investigated according to the of HBV DNA replication stages. To obtain the core particles, which represent the various stages of HBV DNA replication, several HBV mutants were constructed. RT YMHA, reverse transcription deficient, mutant can encapsidate pgRNA but DNA replication is completely blocked by mutation of YMDD reverse transcriptase motif to YMHA. Priming deficient TP Y65F mutant core particles, in which tyrosine 65 in TP domain of HBV DNA polymerase was changed to phenylalanine, can synthesize oligomer, the nascent minus-strand DNA. RH D750V mutant makes core particles containing pgRNA-minus strand DNA hybrid because RNase H activity is blocked by aspartic acid 750. HBV wild type and various mutants were transiently expressed in HuH7 cells and analyzed the intracellular distribution of core particles by immunofluorescence assay and confocal microscopy. From series of replicative stages of core particles, only core particle in late stages of HBV DNA replication with completed minus-strand DNA or relaxed circular DNA genome, can co-localize with microtubule, vimentin and nuclear pore complex of host cells. PART 2 Replication Competent Core Particles of Hepatitis B Virus Were Formed by Chimeric Core Protein Assembly of replication competent HBV nucleocapsid requires interaction of core protein, polymerase and pgRNA of HBV. The N-terminal portion of core protein participates in capsid particle assembly and is, by itself, assembly competent. The C-terminal portion which is rich in arginine residue, is known as nucleic acid binding domain. Although C-terminal domain of core protein is dispensable for capsid particle assembly, this domain is involved in viral replication including pregenomic RNA encapsidation. However critical amino acid residues or motif for pgRNA encapsidaion or DNA replication has not been demonstrated yet. In this study, chimeric core proteins of HBV were produced by substituting the C terminal region of HBV core protein to DHBV to identify critical site of nucleic acid binding domain for HBV replication. Chimeric core proteins were designed to contain various lengths of corresponding DHBV sequences, while N-terminal sequences of HBV core protein were unchanged. Core protein deficient mutant (C deficient) and various core protein chimeras were co-transfected into HuH7 hepatoma cell line to allow virus assembly. In this condition, core proteins were supplied in trans by core protein chimera construct, and pgRNA and other HBV proteins were provided by C deficient mutant. While some chimeric core proteins can support the HBV core particle assembly, the other cannot. The one of particle assembly competent chimeric core protein can support HBV pgRNA encapsidation and HBV DNA synthesis, but the other can support only core particle assembly. C-terminal region of HBV and DHBV core protein is about 40% homologous in amino acid sequence. Our result indicate that 40% of amino acid sequence identity of nucleic acid binding domain is sufficient to complement HBV core proteins which encapsidate HBV pgRNA and synthesize HBV DNA. PART 3 Reverse Transcriptase Activity of Hepatitis B Virus Polymerase Hepadnavirus DNA polymerase functions DNA synthesis from RNA or DNA template and acts as a primer for minus-strand DNA synthesis. From previous studies, endogenous polymerase activity in priming-deficient mutant core particles was found. This result suggest that the priming-deficient mutant polymerase has the ability to synthesize oligomers (presumably nascent minus-strand DNA) in the absence of covalent linkage between TP and the first deoxynucleotide, which means the primer independent initiation by HBV DNA polymerase. This raises a very important question that HBV DNA polymerase may have RNA polymerase feature. In this study, the RNA polymerase activity of HBV DNA polymerase was explored by testing the NTP incorporation capacities. The bulky amino acid, phenylalanine 436, at supposedly dNTP binding cleft of HBV DNA polymerase was changed to smaller amino acids, glycine or valine. NTPs incorporation capacity of HBV DNA polymerase was tested by endogenous polymerase assay with 32P-labeled ATP and cold dNTPs with isolated core particles. HBV DNA polymerase incorporates NTPs by F436 substitution to glycine which is smaller than valine. This result indicates that bulky amino acid in dNTP binding cleft acts as a steric gate in dNTP selections. Even though authentic DNA synthesis was not detected, it was found that HBV DNA polymerase incorporate NTPs by substituting F436 to G. Taken together, these results indicate that single amino acid substitution can blur property of DNA polymerase in the direction of RNA polymerase.-
dc.description.abstractPART 1 다양한 복제단계에서 B형 간염 바이러스의 세포 내 이동 B형 간염 바이러스의 복제는 새로 형성된 캡시드 입자 내에서 일어난다. 캡시드에 싸여 들어간 pgRNA는 DNA 중합효소에 의하여 음성 가닥의 DNA로 역전사 되고, 동시에 DNA 중합효소의 RNase H 작용에 의하여 분해된다. 그 후 양성 가닥의 DNA가 합성되면서 부분적 이중가닥의 환형 DNA 게놈이 완성된다. 이러한 HBV DNA의 복제가 진행됨에 따라 미성숙 캡시드 입자는 성숙한 캡시드 입자가 되며, 성숙한 캡시드는 세포내의 바이러스의 게놈을 증폭시키기 위하여 다시 핵으로 이동하거나 또는 바이러스 입자로 세포밖으로 방출되기 위하여 세포내 막으로 이동하여 바이러스 외피를 얻는다. 이 연구에서는 HBV DNA의 복제가 진행됨에 따른 캡시드 입자의 세포 내 이동을 조사하였다. 다양한 HBV DNA 복제 단계에 있는 캡시드 입자를 얻기 위하여 몇 개의 HBV 돌연변이주를 만들었다. RT YMHA 변이주는 역전사 결손 변이주로 캡시드 내에서 pgRNA가 역전사 될 수 없다. DNA 복제 시동 결손 변이주인 TP Y65F 변이주의 캡시드 입자는 새로 합성된 짧은 가닥의 음성 가닥 DNA를 포함하고 있다. RH D750V 변이주는 DNA 중합효소의 RNase H 작용 결손이므로 캡시드 내에 pgRNA와 음성가닥의 DNA로 이루어진 혼성 가닥을 갖고 있다. HBV wt의 캡시드는 완성된 부분적 이중가닥의 환형 DNA 게놈을 갖고 있으며, 다양한 복제 매개체를 갖는 캡시드도 포함되어있다. 이들 변이주를 HuH7 세포에 발현 시킨 후 면역형광법으로 캡시드 입자의 분포를 조사하였다. 그 결과 DNA 복제 단계에 따라 캡시드의 분포에 차이가 있는 것을 확인하였다. PART 2 키메라 캡시드 단백질로부터 형성된 캡시드 입자의 B형 간염 바이러스 복제능력 B형 간염 바이러스의 뉴클레오캡시드를 형성하기 위해서는 캡시드 단백질, DNA 중합효소, pgRNA의 상호작용이 필요하다. 이 중 캡시드 단백질의 N-말단은 캡시드 입자의 조립에 관여하며 그 자체만으로도 캡시드 조립이 가능하다. 또한 C-말단은 캡시드 입자의 조립에는 관여하지 않지만 핵산 결합 부위로서 pgRNA를 감싸거나 DNA를 복제하는 과정에 관여한다. 그러나 C-말단의 이러한 작용에 중요한 역할을 하는 아미노산이나 도메인은 아직까지 불분명하다. 따라서 이 연구에서는 B형 간염 바이러스 캡시드 단백질의 C-말단을 오리 B형 간염 바이러스 캡시드 단백질로 치환한 키메라 캡시드 단백질을 이용하여 핵산 결합 부위의 중요한 아미노산이나 도메인을 밝히고자 하였다. 키메라 캡시드 단백질은 B형 간염 바이러스 캡시드의 N-말단에는 변화 없이 C-말단을 다양한 길이의 상응하는 오리 B형 간염바이러스 캡시드 단백질의 C-말단으로 치환되도록 제작하였다. 각각의 키메라 캡시드 단백질을 B형 간염 바이러스의 캡시드 결손 돌연변이주와 함께 HuH7 세포에 발현시켰다. 이를 통해 pgRNA와 캡시드 단백질을 제외한 구조 단백질은 캡시드 결손 돌연변이주로부터 제공되고 캡시드 단백질은 키메라 단백질이 제공하도록 하였다. 일부 키메라 캡시드 단백질이 캡시드 입자를 형성할 수 있었고 그 중에 하나는 pgRNA를 감싸거나 DNA를 합성할 수 있었다. 이 키메라 캡시드 단백질을 분석한 결과 오리 B형 간염바이러스의 캡시드로 치환한 C-말단의 아미노산 서열 중 45.2 %가 상동 관계였다. 그러므로 이 결과는 상동관계에 있는 45.2 %의 아미노산이 pgRNA를 감싸고 HBV DNA를 복제하는데 중요한 부분이라는 것을 보여준다. PART 3 B형 간염 바이러스 (HBV)의 DNA 중합효소는 RNA나 DNA를 주형으로 하여 DNA를 합성하는 기능을 갖고 있으며, 바이러스의 음성가닥 DNA를 만드는 과정에서 단백질 프라이머로서 작용하기도 한다. 이전의 연구에서 HBV DNA 중합효소의 시작 결손 변이주가 말단 단백질과 첫번째 디옥시올리고뉴클레오티드 사이의 공유결합 없이도 짧은 DNA 조각을 합성한다는 것을 밝힌 바 있다. 이 사실은 HBV DNA 중합효소가 프라이머 없이 DNA를 합성하는 RNA 중합효소의 특성을 갖고 있을 가능성이 있다는 것을 제시한다. 본 연구에서는 NTP 결합능력을 관찰함으로써 HBV DNA 중합효소에서 RNA 중합효소의 특성을 조사하였다. HBV DNA 중합효소의 dNTP 결합부위에 부피가 큰 아미노산을 부피가 작은 글라이신이나 발린으로 변이시킨 후, NTP 결합능력을 획득하는 지를 확인하였다. 그 결과 HBV DNA 중합효소의 dNTP 결합부위에 위치하는 부피가 큰 436번 페닐알라닌을 글라이신으로 변이시킨 중합효소 변이주가 HBV DNA를 합성할 수는 없었지만 NTP 결합능력이 있음을 확인하였다. 이 결과는 HBV DNA 중합효소의 dNTP 결합부위에 있는 436번 페닐알라닌이 dNTP 선택에 있어서 공간적 관문으로 작용한다는 사실을 의미한다. 본 연구의 결과는 단일 아미노산의 치환에 의하여 DNA 중합효소와 RNA 중합효소 특성의 경계가 불분명해질 수 있음을 나타낸다.-
dc.description.tableofcontents"TABLE OF CONTENTS ABSTRACT = ⅰ TABLE OF CONTENTS = ⅶ LIST OF FIGURES = xi PART 1 = 1 Ⅰ. INTRODUCTION = 1 Ⅱ. MATERIALS AND METHODS = 4 A. DNA construction = 4 B. Cell culture and transfection = 7 C. Isolation of core particles = 7 D. RNase protection analysis(RPA) = 7 E. Northern and Southern Blotting = 8 F. Western blotting = 8 G. Endogenous polymerase assay = 9 H. Immunofluorescence assay(IFA) = 9 Ⅲ. RESULTS = 11 A. Construction of HBV mutants that represent various stages of HBV replication = 11 B. HBV RNA transcription and core particle formation = 12 C. HBV pgRNA encapsidation = 15 D. HBV DNA replication = 15 E. Intracellular trafficking of HBV core particle in various stages of DNA replication = 20 Ⅳ. DISCUSSION = 25 Ⅴ. CONCLUSION = 29 REFERENCES = 31 국문요약 = 38 PART 2 = 40 Ⅰ. INTRODUCTION = 40 Ⅱ. MATERIALS AND METHODS = 42 A. HBV plasmid DNA construction = 42 B. Cell culture and transfection = 44 C. Isolation of core particles = 45 D. RNase protection analysis(RPA) = 45 E. Northern and Southern Blotting = 46 F. Core particle Western blotting = 46 Ⅲ. RESULTS = 47 A. Core protein and chimeric core protein construction = 47 B. HBV RNA transcription = 48 C. Chimeric core particle assembly = 53 D. HBV pregenomic RNA encapsidation by chimeric core proteins = 54 E. HBV DNA replication in chimeric core particles = 57 Ⅳ. DISCUSSION = 60 Ⅴ. CONCLUSION = 63 REFERENCES = 64 국문요약 = 68 PART 3 = 70 Ⅰ. INTRODUCTION = 70 Ⅱ. MATERIALS AND METHODS = 73 A. DNA construction = 73 B. Cell culture and transfection = 74 C. Isolation of core particles = 74 D. RNase protection analysis(RPA) = 75 E. Northern and Southern Blotting = 75 F. Core particle Western blotting = 76 G. Endogenous polymerase assay(EPA) = 76 Ⅲ. RESULTS = 77 A. Construction of HBV DNA polymerase mutant = 77 B. HBV RNA transcription and core particle formation = 81 C. HBV pgRNA encapsidation = 83 D. HBV DNA replication by polymerase mutants = 85 E. NTP incorporation by dNTP binding cleft mutant polymerase = 87 Ⅳ. DISCUSSION = 90 Ⅴ. CONCLUSION = 93 REFERENCES = 94 국문요약 = 98-
dc.description.tableofcontentsLIST OF FIGURES PART 1 Fig. 1. Schematic diagram of HBV replication stages and HBV wild type (wt) and mutants constructs = 13 Fig. 2. HBV RNA transcription and core particle formation = 14 Fig. 3. HBV pgRNA encapsidation = 17 Fig. 4. Southern blot analysis = 18 Fig. 5. Endogenous Polymerase Assay = 19 Fig. 6. Intracellular traffickingof HBV core particles = 24 PART 2 Fig. 1. Schematic diagram of core protein chimera constructs = 51 Fig. 2. HBV RNA expression from HuH 7 cells co-transfected chimeric core protein and C deficient mutant constructs = 52 Fig. 3. Core particle formation from chimeric core protein = 55 Fig. 4. HBV pgRNA encapsidation by chimeric core proteins = 56 Fig. 5. HBV DNA replication by chimeric core proteins = 58 Fig. 6. Summary of results = 59 PART 3 Fig. 1. Alignment of HBV polymerase with DHBV polymerase, HIV-1 and MoMLV reverse transcriptase = 79 Fig. 2. Schematic diagram of HBV wt and mutant constructs used for transient expression = 80 Fig. 3. HBV RNA transcription and core particle formation = 82 Fig. 4. HBV pgRNA encapsidation = 84 Fig. 5. HBV DNA synthesis by mutant polymerase = 86 Fig. 6. Endogenous Polymerase Assay = 89"-
dc.formatapplication/pdf-
dc.language.isoen-
dc.titleInitial Stages of Hepatitis B Virus Replication-
dc.title.alternative초기 단계의 B형 간염 바이러스의 증식-
dc.typeThesis-
dc.identifier.urlhttp://dcoll.ajou.ac.kr:9080/dcollection/jsp/common/DcLoOrgPer.jsp?sItemId=000000000645-
dc.subject.keywordchimeric core protein-
dc.subject.keyworddNTP binding cleft-
dc.subject.keywordHBV polymerase-
dc.subject.keywordhepatitis B virus core particle-
dc.subject.keywordhepatitis B virus replication-
dc.subject.keywordintracellular trafficking-
dc.subject.keywordNTP incorporation-
dc.subject.keywordreplication stages-
dc.subject.keywordB형 간염 바이러스의 복제-
dc.subject.keywordB형 간염 바이러스의 캡시드 입자-
dc.subject.keyworddNTP 결합부위-
dc.subject.keywordHBV DNA 중합효소-
dc.subject.keywordNTP 결합-
dc.subject.keyword복제단계-
dc.subject.keyword세포 내 분포-
dc.subject.keyword키메라 캡시드 단백질-
dc.description.degreeDoctor-
dc.contributor.department대학원 의학과-
dc.contributor.affiliatedAuthor김, 희영-
dc.date.awarded2005-
dc.type.localTheses-
dc.citation.date2005-
dc.embargo.liftdate9999-12-31-
dc.embargo.terms9999-12-31-
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