Production and Characterization of Monoclonal Antibodies against a Recombinant Nfa1 Protein Cloned from Pathogenic Naegleria fowleri

Abstract

OBJECTIVE: In order to use in the immunopathological studies of pathogenic Naegleria fowleri, monoclonal antibodies against a recombinant His-tag fusion Nfa1 protein cloned from pathogenic N. fowleri were produced, and its characterization was elucidated. In addition, to observe the usage in immunological studies, the localization of the Nfa1 protein in N. fowleri was observed by immunofluorescent assay using monoclonal antibodies. METHODS: Six-week-old female BALB/c mice were immunized with a purified recombinant His-tag fusion Nfa1 protein. Cell lines producing McAbs against the recombinant His-tag fusion Nfa1 protein were produced according to the protocol of hybridoma technique using myeloma cells (F0 cell). The McAbs were characterized by isotyping and Western blot analysis. RESULTS: Eight McAbs (A1F, A3C, A6D, A10F, C3A, C6F, C7F, B6B) against the rNfa1 protein were obtained. Eight McAbs isotypes were all IgG2b. The McAbs had high affinity against the recombinant His-tag fusion Nfa1 protein, which was resulted by indirect ELISA. They recognize 17 kDa protein which was defined with the recombinant His-tag fusion Nfa1 protein by Western blot analysis. Also, The Nfa1 protein reacted with eight McAbs showed on pseudopodia and food-cups by a fluorescent microscope. CONCLUSION: Eight hybridoma cell lines (A1F, A3C, A6D, A10F, C3A, C6F, C7F, B6B) secreting high titer of McAbs against the recombinant His-tag fusion Nfa1 protein were established. Also, the localization of the Nfa1 protein reacted with eight McAbs was observed on pseudopodia and food-cups of N. fowleri trophozoites by a fluorescent microscope. Therefore, the anti-Nfa1 monoclonal McAbs will be efficiently used in immunological study of PAME by N. fowleri.

목적: 자유생활아메바는 담수와 토양에서 자유생활을 하는 아메바로서 자연 환경에서는 세균들을 포식하며, 자유아메바 (genus Naegleria) 중 파울러자유아메바 (Naegleria fowleri)는 사람, 마우스 및 다른 실험동물들에서 원발성 아메바성 뇌수막염 (primary amoebic meningoencephalitis; PAME)을 유발하는 것으로 알려져 있다. 본 연구자의 연구실에서는 파울러자유아메바의 cDNA library를 구축하여 파울러자유아메바에 대한 감염혈청 및 면역혈청으로 immunoscreening과정을 통해 항원성과 관련이 있고, 특히 위족 (pseudopodia)에 특이성이 있는 유전자를 클로닝하여 nfa1 (Naegleria fowleri antigen 1)이라 명명하였다. 본 연구의 목적은 병원성 파울러 자유아메바에서 클로닝된 Nfa1 단백질에 대한 단클론항체를 생산하고 그 특성을 검정하고자 하였다. 재료 및 방법: 파울러자유아메바에서 클로닝된 nfa1 유전자로부터 재조합 His-tag fusion Nfa1 단백질을 얻은 다음, 정제하여 생후 6주 된 BALB/c 마우스 암컷에 면역시키고, 마우스의 비장을 적출하여 형질 세포종 (myeloma) 세포주인 F0 세포와 세포융합기술을 이용하여 세포융합을 실행하였다. 재조합His-tag fusion Nfa1 단백질에 대한 단클론항체를 생산하는지를 확인하기 위하여 면역효소흡착법 (ELISA)으로 항원과의 반응 정도를 측정하여, 항체를 분비하는 잡종세포를 선택 배양하였으며, 한계 희석법 (limiting dilution method)을 통하여 단클론항체를 얻을 수 있었다. 결과: 8개의 단클론항체 즉, A1F, A3C, A6D, A10F, C3A, C6F, C7F, B6B를 얻었다. 항원에 대한 항체의 반응을 확인하기 위해 western blotting을 수행하여 반응대를 확인한 결과, 단클론항체 8개 (A1F, A3C, A6D, A10F, C3A, C6F, C7F, B6B)가 17 kDa 크기의 재조합 His-tag fusion Nfa1 단백질과 강하게 반응 하였다. 각각 항체의 종류를 조사하기 위해 isotyping을 실행한 결과, 단클론항체 8개 (A1F, A3C, A6D, A10F, C3A, C6F, C7F, B6B)가 모두 IgG2b였다. 또한, 형광현미경을 통하여 각각의 단클론항체 모두가 아메바의 위족 (pseudopodia)과 food-cups에서 특이성이 나타남에 따라 Nfa1 단백질의 위치를 확인할 수 있었다. 결론: Nfa1 단백질에 대한 8개의 단클론항체를 분비하는 세포주들을 얻을 수 있었으며, 단클론항체를 사용하여 파울러자유아메바의 위족과 food-cups에서 Nfa1 단백질의 위치를 특이적으로 관찰할 수 있었다. 따라서, 본 연구 결과에서 얻어진 Nfa1 단백질에 대한 단클론항체가 앞으로 N. fowleri의 다양한 면역학적 연구에 유용하게 사용될 것으로 기대된다.