Translocations of Actin to Nucleus and p21WAF1 to Cytoplasm after Treatment of HDF Cells with H2O2

Abstract

목적 : 세포는 오랫동안 스트레스에 노출될 경우 조기노화가 유도된다. 이를 stress-induced premature senescence라 부른다. 자외선, 약물 또는 cytokine등 세포외의 자극에 의한 스트레스나 DNA 손상에 의한 스트레스에 의해 조기노화가 유도되는데, 이 경우 세포 내 활성 산소의 증가가 동반되는 것으로 알려져 있다. 본 연구에서는 human diploid fibroblast (HDF) 1차 배양체에 산화적 스트레스의 매개체의 일종인 H2O2를 한 번 또는 반복적으로 투여하여 유도되는 세포의 조기노화 과정에서 나타나는 세포의 변화를 다음의 세 가지 측면에서 연구하고자 하였다. 첫째, 세포의 형태적 변화와 노화와 관련된 유전자 발현을 조사하였다. 둘째, 노화의 마커로 보고된바 있는 actin의 핵 내 이동현상이 H2O2에 의한 산화적 스트레스에 의해서도 반응하는지를 조사하였다. 마지막으로 세포노화 유도에 관여하는 것으로 알려져 있는 cyclin-dependent kinase inhibitor인 p21WAF1의 발현정도와 세포 내 위치에 대해 젊은 세포와 노화가 진행되는 세포에서 H2O2에 대한 반응성의 차이를 조사하였다. 재료 및 방법 : 어린 남아의 포피로부터 분리한 human diploid fibroblast에 H2O2를 200 µM의 농도로 한 번 또는 반복적으로 처리하였다. 세포주기는 propidium iodide로 DNA를 염색하여 fluorescence activated cell sorting (FACS)을 통해서 측정하였으며, reactive oxygen species 생성은 2',7'- dichlorofluorescin diacetate로 염색하여 FACS를 통해서 측정하였다. 단백질의 발현과 세포 내 위치변화는 immunoblotting과 면역형광염색을 수행하여 측정하였다. 세포노화가 진행된 정도는 senescence associated-β-galactosidase (SA-β-gal)의 활성으로 측정하였다. 결과 : 1. H2O2를 한 번 처리한 경우에는 시간이 경과함에 따라 세포의 크기가 커지면서 평평해지는 노화된 세포의 모양을 관찰하였지만 SA-β-gal의 활성은 H2O2를 처리한 후 3일까지 관찰할 수 없었다. 2. H2O2를 반복적으로 처리한 경우 H2O2 처리 횟수에 따라 세포질이 감소하고 긴 filopodia를 형성하면서 일부 세포가 죽는 것이 관찰되었지만 살아있는 세포의 일부분은 SA-β-gal의 활성을 나타내었다. 3. H2O2를 한 번 처리한 경우에는 일시적인 G2/M 정지를 보이는 반면 반복적인 H2O2의 처리는 지속적인 G2/M 정지현상을 보였다. 4. 노화의 마커로 보고된 actin의 핵 내 이동현상은 산화적 스트레스의 일종인 H2O2를 처리한 경우에도 관찰되었으며, 이때 핵 내 축적된 actin이 단량체 actin임을 알 수 있었다. 6. H2O2에 의해 유도되는 p21WAF1의 발현은 노화가 진행된 세포보다는 젊은 세포에서 H2O2 처리 횟수에 비례하여 발현양이 증가하는 것을 관찰하였다. 7. H2O2 처리 후 p21WAF1의 세포질로의 이동은 젊은 세포와 노화가 진행된 세포에서 공통적으로 관찰되었다. 결론 : HDF 세포에 H2O2를 한 번 또는 반복적으로 처리하였을 경우 정상세포에 비해 세포의 성장은 현저히 감소되었다. 그러나 세포의 형태변화와 SA-β-gal의 활성에는 차이를 보였다. H2O2를 한 번 처리 후 3일에 세포형태는 노화의 표현형을 보였지만 SA-β-gal 활성은 관찰할 수 없었다. H2O2의 반복처리는 세포질의 감소와 긴 filopodia 형성을 유도하면서 세포사멸이 관찰되었고 일부 살아남은 세포는 SA-β-gal 활성을 나타내었다. 노화된 세포에서 관찰되는 actin의 핵 내 이동은 H2O2에 의한 산화적 스트레스에 의해서도 나타났으며, p21WAF1의 발현은 노화된 세포에 비해 젊은 세포에서 H2O2를 처리한 횟수에 의존적으로 발현양이 증가하는 것을 관찰하였다. H2O2에 의한 p21WAF1의 세포질로의 이동은 젊은 세포와 노화세포 모두에서 공통적으로 나타나는 현상임을 알 수 있었다. 이 결과로 H2O2에 의한 산화적 스트레스로 세포의 조기노화를 유도할 때 H2O2의 투여 정도에 따라 조기노화 유도 양상이 달라짐을 알 수 있었고, actin의 핵 내 이동과 p21WAF1의 발현 증가 및 세포질로의 이동은 H2O2에 의한 산화적 스트레스 유도 조건에서 공통적으로 나타나는 현상임을 알 수 있었다.