Enhancement of Antitumor Activities of a Selective Cyclooxygenase-2 Inhibitor, Celecoxib on the Lewis Lung Carcinoma that Express Cyclooxygenase-2

Abstract

COX-2 promotes carcinogenesis, tumor proliferation and growth, angiogenesis, prevention of apoptosis, immunosuppression. Selective inhibition of COX-2 activity in several animal models is associated with decrease in new vessel production in tumors, decreases in new vessel formation, and increases in tumor cell apoptosis. And selective inhibition of COX-2 activity is associated with the enhanced radiation sensitivity of tumors without appreciably increasing the effects of radiation on normal tissue. In this study, we experimented to know the effect of selective COX-2 inhibitor to inhibit tumor growth and pulmonary metastasis in animal model. The right thighs of male, 6 week old C57/BL mice were injected subcutaneous with 1 x 106 Lewis Lung Carcinoma(LLC) cells. Animals were randomized to one of six groups: no treatment(group 1), celecoxib 25mg/kg daily per oral intake alone(group 2), celecoxib 75mg/kg daily per oral intake alone(group 3), 10 Gy irradiation alone in one fraction(group 3), 10 Gy irradiation with celecoxib 25mg/kg daily per oral intake(group 5), 10 Gy irradiation with celecoxib 75mg/kg daily per oral intake(group 6). After tumor injection, tumor volume was measured three times weekly. Celecoxib feed orally every afternoon. Mice were irradiated with 4-MV photon when tumor volume of control group had reached 500 mm3. All mice were killed when the mean volume of animals of group 1 grew to 4000 mm3. The left lungs were extracted for measurement of metastatic lung nodules. COX-2 was measured by enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA). The mean tumor volumes were 3802.2 mm3, 3814.4 mm3, 2757.6 mm3, 1942.1 mm3, 1874.3 mm3 and 1319.3 mm3 at the time of sacrifice, respectively from group 1 to group 6. The reduction of tumor volume was statistically significant, comparing between group 1 and group 3, 4, 5, and 6(p=0.0004, <0.0001, <0.0001 and <0.0001 respectively). According to celecoxib dose, the tumor volume was significantly inhibited by high dose celecoxib regardless of radiation. The lung metastasis was detected in all mice of group 1. The rates of lung metastasis from group 2 to group 6 were 100%, 75.0%, 50.0%, 87.5% and 25%. The number of metastatic lung nodules and tumor volume regardless of treatment group were well correlated(p<0.0001). The mean number of metastatic lung nodules was 2.2 at group 1, but 0.5 at group 6. There was no correlation between the size of metastatic nodules and tumor volume(p=0.2408). Treatment with radiotherapy and celecoxib 75mg/kg reduced circulating COX-2 relative to controls(p=0.0528). In conclusion, celecoxib feeding with high concentration inhibits significantly tumor growth, comparing with low concentration. In mice treated with radiotherapy and high dose celecoxib, the effect of tumor growth delay and reduction of lung metastasis were more prominent than mice treated with celecoxib or radiotherapy alone.

선택적 COX-2 억제제가 신생혈관 생성을 억제하고 종양세포의 세포사멸을 증가시켜 종양의 성장을 둔화시키고 전이를 낮출 수 있다고 알려져 있다. 본 연구에서는 동물모델에서 방사선치료와 선택적 COX-2 억제제, celecoxib를 병용할 때 종양 성장 및 전이에 끼치는 영향을 알아보고자 하였다. 생후 6주된 C57/BL 수컷 마우스의 오른쪽 뒷다리에 Lewis Lung Carcinoma (LLC) 세포 1 X 106/0.1ml씩 주사하였다. 치료에 따라 다음과 같이 6군으로 나누었는데 1군-대조군, 2군-celecoxib 25mg/kg/일 복용, 3군-celecoxib 75mg/kg/일 복용, 4군-방사선치료 10 Gy 단독, 5군-방사선치료 10 Gy와 celecoxib 25mg/kg/일 복용, 6군-방사선치료 10 Gy와 celecoxib 75mg/kg/일, 각 군당 마우스 12두씩 배정하였다. 종양세포 주사 후 매주 3회씩 종양의 크기를 측정하여 종양 체적을 계산하였다. Celecoxib는 종양세포 주사한 날부터 매일 오후에 존대를 이용하여 복용하였다. 방사선치료는 대조군의 종양체적이 평균 500mm3 되었을 때 4 MV 광자선을 이용하여 종양 부위에 bolus를 덮고 종양에 국한하여 10 Gy/1회 조사하였다. 대조군의 평균 종양 체적이 4000mm3가 되었을 때 모든 마우스를 안락사하였고, 종양과 좌측 폐를 적출하였다. 전이된 종양 개수를 측정하기 위하여 적출된 폐는 포르말린 용액에 고정 후 H & E 염색을 시행하였다. 안락사 후 생쥐의 혈액에서 혈장을 분리하여 효소면역측정법으로 COX-2농도를 측정하였다. 각 군별 종양 평균 체적은 1군부터 6군까지 각각 3802.2 mm3, 3814.4 mm3, 2757.6 mm 3, 1942.1 mm3, 1874.3 mm3, 1319.3 mm3였다. 종양체적 변화를 대조군과 비교해 보면, celecoxib 75mg/kg을 섭취한 3군, 방사선치료가 시행된 4군, 방사선치료와 celecoxib 섭취가 병행된 5군과 6군은 모두 통계적으로 유의한 차이가 있었다(각각 p=0.0004, <0.0001, <0.0001, <0.0001). Celecoxib만 섭취한 경우 섭취 용량에 따라 종양 성장 정도가 차이가 있었는데 세포 주입 후 20일째 celecoxib 25mg/kg과 75mg/kg 섭취 군간의 종양 체적이 의미있는 차이가 있었다(p=0.0004). 또한, 방사선치료가 시행된 경우에도 celecoxib 75mg/kg 섭취군에서 25mg/kg 섭취군보다 종양 억제 효과가 뚜렷하였다(p=0.0144). 대조군의 모든 마우스에서 폐 전이 결절이 발견되었고, 처치군 2군부터 5군까지 폐 전이율은 각각 100%, 75.0%, 50.0%, 87.5%로 대조군과 뚜렷한 차이가 없었으나, 방사선치료와 celecoxib 75mg/kg을 섭취한 군의 폐 전이율은 25.0%로 대조군에 비해 현저히 낮았다. 폐 전이 결절 정도와 전체 마우스의 종양 체적을 분석해 보면 종양 체적에 따라 전이 종양 정도의 연관성이 뚜렷하였다(p<0.0001). 평균 폐 전이 결절 수가 대조군에서 2.2개 였으나 방사선치료와 celecoxib 75mg/kg을 섭취한 군에서는 0.5개로 현저히 낮았다. 전이된 결절 크기는 방사선치료와 병행하여 celecoxib 75mg/kg을 섭취한 군에서 제일 작았지만 처치군에 따라 전이 결절 크기의 뚜렷한 경향성은 찾을 수 없었다. 또한, 폐 전이가 있었던 마우스들에서 종양 체적과 전이 결절 크기의 상관관계는 없었다(p=0.2408). 혈장 내 COX-2 농도는 대조군에 비해 방사선치료와 celecoxib 75mg/kg을 처치한 군에서 통계적 의의에 근사하게 낮았다(p=0.0528). 세포주 이종이식편에서 선택적 COX-2 억제제인 celecoxib 75mg/kg 섭취시 대조군이나 celecoxib 25mg/kg 섭취시와 비교하여 혈장 내 COX-2 농도를 낮추고, 종양성장이 의의있게 억제됨을 알 수 있었다. 또한, celecoxib 75mg/kg를 방사선치료와 병행한 경우에 celecoxib만 섭취하거나 방사선치료만 시행한 경우보다 종양 성장 억제 효과가 더 뛰어나며 폐 전이도 줄일 수 있음을 확인하였다. 향후 다양한 세포주에 대한 선택적 COX-2 억제제와 방사선치료의 병행시 효과의 기전 연구 및 방사선치료시 통상분할조사(conventional fractionation)와 소분할조사(hypofractionation)에 따른 COX-2 억제제의 종양 억제 및 전이에 대한 비교 연구가 필요하겠다. 또한, 임상적으로 종양 억제 효과를 위해 celecoxib를 적용하기 위해서는 다양한 전임상 및 임상 연구가 필요하리라 생각된다.