Functional study of Gap Junctional Intercellular Communication in Human Keratinocyte Cell Line

Abstract

Gap junctions, unique membrane structures that mediate the intercellular communications among almost all tissues, are composed of connexins in vertebrate. The essential role of gap junction-mediated intercellular communications(GJIC) for coordination of cell homeostasis, tissue functions and organ development are well reported by many researches using genetics and mutant studies. Mutations of connexin 26 and connexin 30 have been linked to deafness. In human middle ear cholesteatoma, upregulated expression of both connexin 43 and connexin 26 were observed compared to those in normal human skin. In this study, spontaneously immortalized non-tumorigenic and a highly diffenrentiating keratinocyte(HaCaT) cell line was used to find substances that can change the GJIC function via fuctional study using scrape-loading dye transfer(SLDT) method. Toxic drug level of acetic acid , H₂O₂, dexamethasone, Epicatechin epigallocatechin-3-gallate, Epicatechin and retinoic acid were assesed by Neutral red uptake test. The adequate concentration of these six material was determined and added to the culture medium of the HaCaT cell line. Scrape-loading dye transfer method was used to compare the functional aspect of GJIC in the different condition, By this method, fluorescent Lucifer yellow dye was introduced into the HaCaT cells and observed by the fluorescence inverted microscope. Captured images were analysed with image software and as a result, acetic acid, hydrogen peroxide, dexamethasone have down-regulated and epicatechin have up-regulated the GJIC function showing statistically significant difference(p<0.05) of the mean diffusion length of Lucifer yellow dye compared to that of the control group. The discovery of these substances will lead to the success of the medical treatment of cholesteatoma.

세포간 간극결합(Gap junction intercellular communication)을 통한 세포간 신호전달의 체계는 매우 정교하며, 다양성을 갖는다. 이런 다양성을 발현시키며 간극결합을 구성하는 단백질인 connexin의 유전적인 발현 및 돌연변이 연구에 따르면, 간극결합을 통한 세포간 신호전달 체계가 조직의 기능과 장기의 발달에 필수적이라는 직접적 증거가 발견되었다. 특히 이비인후과 영역에서는 connexin 26, connexin 30이 deafness를 유발하는 유전질환과 연관되어 있음이 널리 알려져 있으며, 심한 중이염을 일으키는 원인중 하나인 진주종에서도 connexin의 발현이 정상 세포와는 다르다고 보고되었다. 이 연구에서는 진주종과 유사하다고 알려진 사람 상피 세포주인 HaCaT 세포주의 간극결합을 조절할 가능성이 있는 물질을 선택하였고, Acetic acid , H₂O₂, dexamethasone, Epicatechin epigallocatechin-3-gallate 와 Epicatechin, retinoic acid의 6가지 물질의 세포독성과 실험에 쓰일 적정 농도를 Neutral red uptake test를 시행하여 측정하였다. 이 결과에서 정해진 적정농도의 각 물질이 함유된 배지에서 자란 HaCaT세포주의 세포간 간극결합의 기능을 평가하기 위해, 이 세포간 결합을 통과할 수 있는 Lucifer yellow dye를 배지에 투여하면서 Scrape-loading and dye transfer 방법을 사용하여, 세포 내로 Lucifer yellow 분자를 투입시킨 후 세포간 확산이 진행된 결과를 형광현미경으로 관찰하였다. 현미경에서 사진을 촬영하여, 각 물질이 간극 결합의 기능에 얼마나 영향을 미쳤는지를 분석하여 이 물질 중에 Acetic acid (0.1%), H₂O₂ (5uM), dexamethasone (100 ug/ml)가 세포간 간극결합의 기능을 저하시켰으며, Epicatechin (50 ug/ml)이 기능을 상승 시켰음을 확인하였다. 이 연구결과를 통하여 HaCaT 세포주의 세포간 간극결합의 기능을 조절할 수 있는 물질이 진주종 치료물질로서의 적용 가능성 있음을 제시하고자 한다.