The regulation of stemness using the ligands of human ES cell-specific factor

Abstract

Human embryonic stem cells (hESC) have been regarded as promising resources for therapeutic uses with self-renewal property. Recent studies have discovered various transcription factors underlying stemness of hESCs. However, no membrane receptors related to stemness are known so far. We identified a novel GPCR protein HECAT5 as a candidate molecule regulating stemness using digital differential display (DDD). When we overexpressed HECAT5 in hNSC and HEK293 cells, it dramatically increased cell proliferation as well as S phase population. While investigating signaling pathway underlying the effect of HECAT5 in cell proliferation, we found that treatment of Gq protein inhibitor, YM254890, did not affect cell proliferation induced by HECAT5. Furthermore, the level of ERK and AKT which are downstream molecules of β-arrestin pathway did not change in HECAT5-overexpressed cells. Next, we aimed to identify ligands which may modulate HECAT5 activity. We found nonanoic acid which showed approximately 70% binding affinity to HECAT5 via ODORactor website. We observed that nonanoic acid increased cell proliferation, while there was no difference in ERK and AKT level, which means it is not HECAT5-specific ligand. Generally, GPCR goes through conformational change upon their activation and Toggle switch and Ionic lock are involved in this mechanism. Based on the fact that HECAT5 has both Toggle switch and ionic lock with highly conserved and candidate odors analyzed from reference dataset, we established the homology model of HECAT5. This results in approximately 140 candidate chemicals after screening various commercial chemical libraries. In this respect, we anticipate that HECAT5 activity modulators may play a role in increasing the efficiency of iPSC generation or in blocking certain type of cancer cells.

인간 배아줄기세포는 자가 증식능, 다분화능의 특징을 가지며 세포치료제로써 각광받고 있는 재료이다. 최근 인간 배아줄기세포의 줄기성을 관장하는 여러가지 전사인자들이 밝혀지고 있다. 하지만, 줄기세포의 줄기성을 조절하는 세포막 수용체는 알려진 바가 없다. 우리는 DDD를 통해 인간 배아줄기세포 특이적인 유전자 HECAT5를 발굴하였다. HECAT5의 과발현은 세포 내에서 세포 증식을 촉진시켰다. 이와 관련된 세포 내 신호전달 과정을 조사하는 중, Gq 단백질 저해제인 YM254890을 처리하였으나 세포 증식에는 영향을 주지 않았고, β-arrestin 전달경로의 마지막 분자인 ERK, AKT 단백질 양 또한 변화가 없었다. 우리는 HECAT5의 활성을 조절할 수 있는 리간드를 찾고자 하였다. 먼저, ODORactor를 통해 HECAT5와 약 70%의 결합가능성을 가지는 nonanoic acid를 찾았다. Nonanoic acid의 처리는 세포 증식을 촉진시켰으나, ERK와 AKT의 양은 그대로였기에 HECAT5 특이적인 리간드는 아닌 것으로 밝혀졌다. GPCR은 활성화가 되면 세포막 통과 도메인에 구조적인 변화가 일어나는데, 이 때 Toggle switch와 Ionic lock이 중요한 역할을 한다. 우리는 시퀀스 비교를 통해 중요한 두 가지 모티프가 HECAT5에도 잘 보존되어 있음을 확인하였다. 또한 레퍼런스 공개 자료를 분석하여, HECAT5와 반응을 보이는 천연 화합물 6가지를 발굴하였다. 후각수용체의 구조적인 변화와 후보 물질들을 기반으로 하여 HECAT5의 호몰로지 모델을 구축하였고, 여러 가지 화합물 라이브러리를 스크리닝하여 약 140개의 화합물을 HECAT5 활성 조절인자 후보군으로 선별하게 되었다. 추후 이들의 역할을 조사하여 역분화세포의 효율을 높이거나 혹은 특정 암세포의 저해제를 개발하는 등의 응용을 기대하고 있다.