중추신경계 축삭 손상 이후 적핵척수로 신경세포에서 활성화된 전사인자 c-Jun 발현의변화

Abstract

중추신경계 신경세포의 축삭 재생 능력은 말초신경계 신경세포에 비해 매우 감소되어 있다. 말초신경계 축삭 손상 이후 후근 신경절 감각 신경세포들은 재생관련 유전자들의 발현을 급격히 증가하여 축삭재생 능력을 상승시키는 것으로 알려져 있다. 이와 대조적으로 척수 손상과 같은 중추신경계의 손상 이후에는 신경세포체에서 재생관련 유전자의 발현증가가 관찰되지 않고, 이러한 손상 후 재생관련 유전자 발현 유도의 결여가 중추신경계 축삭재생 실패의 중요한 내인성 요인으로 인식되고 있다. 본 실험실에서는 선행연구를 통하여 말초신경계 축삭 손상 이후 후근 신경절 감각신경세포 주변에 대식세포가 활성화 되는 것을 관찰하였으며, 이러한 대식세포의 활성화가 재생관련 유전자를 증폭하거나 혹은 수개월 이상의 장기간의 발현 증가 유지에 중요한 역할을 수행함을 입증한 바 있다. 반대로 동일한 후근 신경절 감각신경세포의 중추신경계 축삭이 손상되었을 경우 대식세포의 활성화가 일어나지 않음을 관찰하여, 중추신경계 축삭 재생의 실패가 대식세포 활성화의 실패가 관련이 있을 가능성을 시사한 바 있다. 하지만 기존의 연구들은 중추신경계 축삭 재생의 실패가 절단에 의하여 손상된 축삭 말단에서 생성되는 후향성 손상신호(retrograde injury signal)가 세포체로 잘 전달이 되지 않고 이로 인하여 재생관련 유전자의 발현이 유도되지 않는 것과 밀접한 관련이 있다고 보고하고 있다. 나는 중추신경계 축삭 손상 후 잘 알려진 재생관련 유전자의 하나인 c-Jun 전사인자의 활성화를 축삭이 절단된 중추신경세포에서 발현하는 관찰하고자 하였다. 또한 c-Jun 활성화를 유도하는 후향성 손상신호가 중추신경계 이후 발생하고 세포체로 잘 전달이 되는가를 조사하고자 하였다. 나는 중추신경 축삭 절단 모델로 경추 4번에 해당하는 척수에 반측절제술을 시행한 후, 손상 받은 척수의 반대측 적핵척수로 신경세포(rubrospinal neuron)에서 재생관련 유전자의 발현과 대식세포 활성화를 조사하였다. 축삭이 절단된 적핵척수로 신경세포를 확인하기 위해 손상 받은 축삭말단 부위에 신경세포 신호를 역행 추적하는 Fluoro-Gold를 병변 주변에 주입하고 Fluoro-Gold가 양성이 신경세포에서 재생관련 유전자의 발현을 조사하였다. 조사한 재생관련 유전자 중 GAP-43, phospho-STAT3의 발현이 관찰되지는 않았지만, phospho-c-Jun의 뚜렷한 발현 증가를 관찰할 수 있었다. 예상했던 바와 같이 축삭이 손상된 적핵척수로 신경세포 주위에 IBA-1 양성 대식세포의 활성화는 관찰할 수 없었다. 다음으로 축삭이 절단 된 후 1일, 3일, 7일, 14일, 28일 시간 경과에 따라 적핵 신경세포에서 phospho-c-Jun 의 발현이 어떻게 변화 되는지 관찰하였는데, 손상 후 약 3일 경부터 발현이 증가하여 7일째에 가장 많이 발현하고 14일째부터는 감소하여 28일째에는 대조군과 같은 정도로 감소함을 관찰하였다. 또한 축삭손상 후 축삭 말단에서의 후향성 손상신호의 발현양상을 western blot으로 조사하였는데, phospho-JNK와 phospho-STAT3가 모두 손상 근위부 척수에서 1, 3일째에 활성화됨을 관찰하였는데, 적핵이 존재하는 중뇌에서는 phospho-JNK의 활성 증가는 관찰할 수 있었으나 phospho-STAT3의 활성증가는 관찰할 수 없었다. 이러한 실험결과는 중추신경계계 축삭 손상 이후에도 JNK와 STAT3가 후향성 손상신호로 작용하고 있음을 시사하였고, 이 중 STAT3는 세포체에서는 신호가 억제되고 JNK 활성화에 의한 c-Jun의 활성화만이 후향성 손상신호로 신경세포체에 전달될 것을 생각되었다. 이렇게 일시적 증가만 관찰되고 장기적인 유지가 일어나지 않음을 알 수 있었다. 나는 활성화된 c-Jun이 최소한 수개월간 발현 증가가 유지되는 말초신경계와 달리 중추신경계계 축삭 손상 이후에는 1-2주 이후 phospho-c-Jun 발현이 감소되는 것이 축삭손상 후 신경세포 주위에 대식세포 활성화가 일어나지 않는 것과 연관이 있을 것으로 생각하였다. 본 실험실의 선행연구에서 말초신경 축삭손상 후의 대식세포 발현 증가가 CCL2에 의하여 매개됨을 관찰한 바 있었다. 따라서 나는 CCL2를 중추신경계 세포체 주위에 주사하면 재생촉진 대식세포가 활성화되고, 이로 인하여 축삭 손상 후 재생 관련유전자의 발현증가가 오랫동안 유지될 것이라는 가설을 세우고, 재조합 CCL2를 대뇌 신경세포체 주위에 주사하였다. 하지만 예상과는 달리 CCL2 주사에 의한 대식세포의 활성화를 전혀 관찰할 수 없었다. 이러한 이유가 뇌조직 특이적 대식세포인 소교세포와 말초대식세포의 특성 차이인가를 알아보기 위하여 CCL2 수용체인 CCR2와 CCR4의 발현을 조사하였는데, 말초대식세포에 비하여 소교세포에서는 두 수용체 모두 발현이 매우 저하되어 있었고, CCL2에 의해서 발현이 증가하지도 않았다. 또한 말초 대식세포는 CCL2 처리에 의하여 M2 타입의 재생촉진 표현형을 나타내었지만, 소교세포에서는 이러한 반응이 관찰되지 않았다. 나는 본 석사학위 연구를 통하여 중추신경계 축삭 손상 이후에도 말초신경계 축삭 손상에서 관찰되는 후향성손상신호가 생성되고 근위부로 전달됨 알 수 있었고, 이러한 후향성손상신호에 의하여 활성화는 c-Jun 전사인사의 인산화는 말초신경계와는 달리 일시적인 증가만을 보이고 장기간 활성화가 유지되지 않음을 관찰하였다. 이러한 현상은 중추신경계 축삭 손상 이후 신경세포체 주위에서 대식세포가 활성화되지 않는 것과 연관이 있을 것을 시사하였다. 하지만 말초신경계계 축삭 손상 이후 재생촉진 대식세포를 활성화시키는 CCL2의 수용체가 소교세포에서는 발현이 매우 저하되어 있고, 이로 인하여 CCL2 주사에 의한 대식세포의 활성화 관찰되지 않았다. 이러한 결과들은 중추신경계 축삭 손상 후 재생이 일어나지 않는 것이 후향성손상신호가 생성되지 않기 때문이 아니라 재생촉진 대식세포의 활성화 결여로 재생관련 유전자의 활성화가 장기간 유지되지 않기 때문임을 시사하였다. 또한 중추신경계에서 재생촉진 표현형을 가지는 대식세포를 활성화시키기 위해서는 CCL2 이외의 다른 케모카인 신호가 필요할 것임을 시사하였다.