Angiogenesis and neuroprotection according to the administration methods of erythropoietin and Mechanical Barrier Disruption on ischemic rat model

Abstract

Background and PURPOSE: Moyamoya disease is a common cerebrovascular disease in Asian populations. It caused progressive stenosis of willisian circle and the internal carotid artery of the cerebral vessels, (1) chronic hypoperfusion intracranial state and (2) vascular changes in the periphery circle of Willis which is an intracranial collateral vessel. Therefore, it is known that the only treatment is to directly connect blood vessels in the intracranial region and the extracranial region, or indirectly to facilitate the revascularization of the blood vessels. Since the experimental model of the disease developed so far fails to sufficiently express the characteristic clinical features, there are many limitations in understanding the mechanism of onset to the disease or developing therapeutic methods. It is well known that the factors related to the neuroprotective effect in the blood or cerebrospinal fluid of patients with Moyamoya disease, resulting in 'ischemic tolerance' in which ischemia is reduced when a new stroke occurs. Therefore, the first objective of this study is to establish an experimental animal with the above two characteristics, with neuroprotective effect on acute ischemic stroke and ischemic preconditioning. In addition, we evaluated angiogenesis and neuroprotection according to the administration methods of erythropoietin, which has the effect of promoting angiogenesis, in mechanical barrier disruption, which is the minimally invasive surgery to promote revascularization METHODS: Step 1_To establishment of an ischemic preconditioned animal model, bilateral internal carotid occlusion was performed for 1-3 weeks and then the middle cerebral artery temporarily occluded for 90 minutes to find the cerebral infarction area was the smallest and the highest survival rate. We also compared the cerebral blood flow, behavioral tests, and cerebral infarct size correlations to select the suitable animal model and detected blood vessel change in the circle of willis. Step 2_ The establish animal model was temporarily occluded in the right middle cerebral artery for 90 minutes and then erythropoietin was administered single dose(5000 U / kg) intraperitoneally and locally to the scalps 2 hours after the occlusion. The functional recovery, neuroprotective and angiogenesis effect were compared according to the site of administration methods. RESULTS: Step 1_When comparing the duration of preconditioning, 2 week ischemic condition animals with the lowest cerebral infarct size (167mm3) and the highest survival rate (100%). We selected as the final model in subjects who underwent bilateral internal carotid occlusion for 2 weeks. The suitable animal model was considered to be preconditioned and selected as the final model because of its characteristic that cerebral infarction occurs only animal whose blood flow is less than 60% and neurological behavior score is over 10 points. There was a decrease (p = 0.05) in the major vessels around the Willis circle (internal carotid artery, posterior communicating artery, middle cerebral artery, and basilar artery) in the selected final model compared to the sham model. Step 2_Comparing the vascular density of the model with occlusion of the right middle cerebral artery for 90 minutes (79%), the vascular density was increased (91%, p=0.005) in all the administration groups of erythropoietin, but there was no difference between the intraperitoneal administration and the local administration in the scalp. Comparing the size of cerebral infarcts in the animal model as in the previous experiment (246mm3), it was shown that the ischemic preconditioning model had a neuroprotective effect in the intraperitoneal administration group of erythropoietin with a decrease in cerebral infarct size (142mm3). However, in the local administration in the scalp group (198mm3), the size of the cerebral infarction was similar and the neuroprotective effect was not proved. CONCLUSION: We established an ischemic preconditioned animal model with hypoperfusion status and changes in the peripheral vessels of the Willisian Circle. In this model, there was no difference in anigogenic effect according to the mechanical barrier disruption and erythropoietin single dose administration and methods. However, since the intraperitoneal administration was effective only for the neuroprotection, multi dose administration of erythropoietin I expect it will work.

연구배경 및 목적: 모야모야병은 아시아인에서 흔한 뇌 혈관 질환으로, 뇌 혈관의 내경 동맥 및 윌리스환 주변부의 진행성 협착으로 인한 (1) 두개강 내 저관류상태와 (2) 두개강 내 측부혈관인 윌리스환 주변부의 혈관변화를 특징으로 한다. 따라서 혈류가 부족한 두개 내, 외 지역의 혈관을 직접 연결하거나 간접적으로 혈관재건을 촉진시키는 수술이 유일하다. 지금까지 개발된 본 질환의 실험 모델은 특징적인 임상 양상을 충분히 표현하지 못했기 때문에 발병 메커니즘을 파악하거나 치료 방법을 개발하는 데 제한점이 많았다. 두개강 내 저관류 상태에 있는 모야모야병 환자의 혈액이나 뇌척수액에서 신경보호와 관련된 인자들이 증가되어 있어 새로운 뇌졸중이 발생했을 때 허혈이 줄어드는 ‘허혈 내성(ischemic tolerance) 혹은 허혈성 전조건화(ischemic preconditioning)’가 나타난다는 것이 잘 알려져 있다. 따라서 본 연구의 첫째 목적은 제작한 동물 모델이 허혈성 전조건화가 있어 급성 허혈성 뇌졸중에 대해 신경보호가 있으면서 위에서 언급한 두가지 특징을 가지는 실험동물을 제작하는 것이다. 둘째, 혈관재건을 촉진하는 최소 침습수술인 물리적장벽파괴술과 병행하여 신생혈관생성 촉진효과가 있는 에리트로포이에틴의 투여 방법에 따른 신생혈관생성 및 신경보호 정도를 평가한다. 연구방법: 단계 1_허혈성 전 조건화된 모야모야 동물모델을 확립하기 위해 양측내경동맥 폐색을 1-3주간 시행하고 이후 중대뇌동맥을 90분간 일시적으로 폐색하여 뇌경색 부위가 가장 적고 사망률이 낮아 적절한 허혈내성이 일어나는 조건을 확립하기 위해 뇌혈류량, 행동실험, 뇌경색의 크기의 상관관계를 비교하였고 윌리스환 주변부의 혈관변화를 확인했다. 단계 2_제작된 동물모델에 우측 중대뇌동맥에 90분간 일시적으로 폐색한 후 2시간에 에리트로포이에틴을 복강내 및 두피내에 국소적으로 단회투여(5000U/kg)하여 투여 방법에 따른 기능적 회복과 신경보호, 신생혈관생성 정도를 비교 하였다. 연구결과: 단계 1_영구적 중대뇌동맥폐색 모델(370mm3)과 비교할 때, 양측 내경동맥 폐색으로 허혈성 전 조건화를 1-3주간 시행한 개체에서 중대뇌동맥폐색을 시행하였을 때 2주간 시행한 개체에서 뇌경색의 크기(167mm3) 가 줄어들었고, 생존률(100%)도 가장 높아 적합한 개체로 간주되었다. 2주간 내경동맥 폐색 동물에 중대뇌동맥을 폐색하여 내경동맥 폐색 전상태와 비교하여 혈류량이 60% 미만이고 신경학적 행동점수가 10점 이상을 보이는 개체에서만 뇌경색이 나타나는 특성이 있었기 때문에 허혈성 전 조건화가 발생한 것으로 간주되어 적합한 동물모델로 최종 선택되었다. 가짜 수술 모델과 비교하여, 선택된 최종모델에서 윌리스환 주변의 주요혈관(내경 동맥, 후교통동맥, 중대뇌동맥, 뇌기저동맥)의 감소(p=0.05)가 있었다. 단계 2_우측 중대뇌동맥을 90분간 일시적으로 폐색한 모델의 경색주변부위(peri-infarct area) 혈관 밀도(79%)를 비교하여, 에리트로포이에틴 투여 그룹이 혈관밀도(vessel density)가 증가(91%, p=0.005)하였지만 복강내 투여군과 두피내 국소적 투여 군간에는 차이가 없었다. 앞선 실험과 같이 동물모델의 뇌경색 크기(246mm3)를 비교하여, 확립된 동물모델에서 에리트로포이에틴의 복강 내 투여 그룹이 뇌경색 크기(142mm3)가 감소하여 신경보호효과가 있었지만 두피내 국소적 투여 군에서는 뇌경색 크기(198mm3)가 비슷하여 신경보호효과를 입증하지 못했다. 결론: 저관류 상태를 유지하고 윌리스환 주변부 혈관의 변화가 있는 허혈성 전 조건화 모야모야 동물모델을 확립하였다. 이 모델을 통해 물리적장벽파괴술과 에리트로포이에틴의 단회투여와 투여방법에 따른 신생혈관생성에는 차이가 없었지만, 신경보호에는 복강내 투여만이 효과가 있었으므로 에리트로포이에틴의 다수투여가 투여방법에 따른 효과가 있으리라 기대한다.