Effects of Scopolin on osteoblast and osteoclast differentiation

Abstract

Osteoporosis is a bone disease that increases the risk of fractures owing to low bone mineral density (BMD). An imbalance between bone formation (osteoblasts) and bone resorption (osteoclasts) causes osteoporosis. In our previous study, the anti-osteoporotic effects of Lycii Radicis Cortex (LRC) were reported in vitro and in vivo. Fractionation and isolation of the bioactive compound responsible for the anti-osteoporotic effects of LRC extract were performed and Scopolin was identified as a candidate component. Next, the osteoporotic effects of Scopolin were investigated in osteoblasts and osteoclasts. Scopolin significantly increased alkaline phosphatase (ALP) activity and ALP positive-stained colonies expressed in the osteoblastic cell line MC3T3-E1 as compared to non-treated cells, indicating an increase in osteoblast differentiation. The mRNA levels of osteoblast markers such as Alp, Runx2, Bglap, and Sp7 as well as mineralized nodule formation significantly increased in Scopolin-treated MC3T3-E1 cells. In addition, Scopolin reduced tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) activity and TRAP-positive staining of primary-cultured monocytes derived from mouse bone marrow, indicating a decrease in osteoclast differentiation. The mRNA levels of osteoclast differentiation markers such as Tnfsf11 and Nfatc1 significantly decreased. Consistently, Scopolin induced osteoblast differentiation but reduced osteoclast differentiation upon co-culture with osteoblastic MC3T3-E1 and primary cultured monocyte cells. In the in vivo experiments using ovariectomized (OVX) mice as an osteoporosis animal model, the Scopolin-administered OVX mouse group showed significantly reduced BMD loss as compared to the OVX control mouse group. The microcomputed tomography and single photon emission computed tomography results indicate that Scopolin prevented trabecular bone loss and osteoclastogenesis in OVX mice. In addition, the serum OPG/RANKL ratio, which is used as a bone formation marker, was higher in the Scopolin-administered group than in the OVX control group. Collectively, the results of this study indicate that Scopolin effectively enhances bone formation and reduces bone resorption during the bone remodeling process and suggest that Scopolin might be a potential therapeutic agent for the treatment of osteoporosis.

골다공증은 뼈의 밀도가 낮아져 그 강도가 약해지면서 골절이 증가되는 질환을 말한다. 최근 고령화의 진전에 따른 골다공증 환자 수가 급격하게 증가하고 있다. 세계적으로 가장 많이 사용되는 골다공증 치료제로 비스포스포네이트 같은 약제가 있으나, 부작용이 많아 장기 투여가 어려우며, 새로운 뼈 생성에 의한 골밀도 증가에는 큰 역할을 하지 않는다는 단점이 있다. 따라서 장기 복용에도 부작용이 적고 골밀도 개선에 효과가 있는 천연물 유래물질의 치료제의 개발이 필요하다. 본 연구에서는 골다공증에 효과가 있다고 밝혀진 천연물인 지골피(Lycii Radicis Cortex)에서 추출한 물질 중 하나인 Scopolin의 골다공증 개선 효능에 대한 in vitro 및 in vivo 연구를 수행하였다. 먼저 Scopolin의 조골세포의 골형성(bone formation) 효능에 대한 실험을 시행하였다. 조골모세포인 MC3T3-E1에 Scopolin을 처리하여 조골세포 분화능 지표인 alkaline phosphatase(ALP)의 활성을 분석한 결과 Scopolin 처리한 MC3T3-E1의 조골세포 분화가 유의하게 증가되었으며 조골세포 분화 마커인 Alp, Runx2, Bglap, Sp7의 mRNA 발현도 유의하게 증가되었다. 또한, Alizarin red S 염색 결과에서 뼈형성 과정에 나타나는 조골세포의 석회화 결절형성(mineralized nodule formation)이 증가되었다. 다음은, Scopolin의 파골세포 골흡수(bone resorption)에 대한 영향을 조사하였다. 마우스 골수로부터 분리·배양한 초대배양 단핵세포(primary-cultured monocyte)에 Scopolin을 처리하였을 때 tartrate-resistant acid phosphatase(TRAP) 활성과 파골세포 분화 마커인 Tnfsf11과 Nfatc1의 mRNA의 발현량이 유의하게 감소하였다. 신체내에서는 조골세포와 파골세포가 공존하며 뼈 리모델링(bone remodeling)이 조절된다. 이러한 신체내 조건에 가까운 환경에서의 Scopolin 효과를 분석하였다. 조골세포 전구체인 MC3T3-E1과 파골세포 전구체인 monocyte의 두가지 세포를 함께 공배양(co-culture)하여 Scopolin을 처리한 결과, ALP 증가와 TRAP 감소가 나타났다. 끝으로, Scopolin의 in vivo 효과를 조사하였다. 골다공증동물 모델은 난소절제(ovariectomized, OVX) 마우스를 제작하여 실험에 사용하였다. Scopolin을 12주간 구강주입한 OVX 마우스는 대조군과 비교시에 골밀도(bone mineral density), 혈액에서의 OPG/RANKL 비율, micro-CT와 뼈 스캔(SPECT scan)에서의 뼈의 미세구조 및 뼈 굵기 등의 전반적인 골다공증 평가 자료에서 유의한 개선 효과가 나타났다. 결론적으로, 지골피 에탄올 추출물의 효능성분인 Scopolin은 조골세포의 분화 증진을 통한 뼈 형성 촉진과 파골세포의 분화억제를 통한 뼈 흡수 억제에 효능이 있음을 증명하였다. 또한, 동물실험에서 Scopolin이 난소절제에 의해 나타나는 골다공증의 개선 또는 치료에 좋은 효과가 있음을 밝혔다. 본 논문에서 밝혀진 Scopolin에 대한 연구결과가 향후 Scopolin를 이용한 골다공증 치료제 개발에 기초자료로 활용될 수 있기를 기대한다.