The Role of PKC-δ in Hypoxia-induced Cerebrovascular Endothelial cell death.

Abstract

In various cell types, PKC(protein kinase C)-δ has been found to be an important mediator during hypoxia-induced cell death. However, the role of PKC-δ in cerebrovascular endothelial cells is unknown. Therefore, we investigated the role of PKC-δ during hypoxia-induced cell death using bEnd.3 cell, a cerebrovascular endothelial cell line. The activity of PKC-δ increased remarkably after 1 hour of hypoxic injury, and the increase was maintained until 4 hours of hypoxia. To investigate the role of PKC-δ during hypoxia in terms of cell death, we measured the amount of released LDH (lactate dehydrogenase) and trypan blue positive cells during hypoxia after treatment with rottlerin, PKC-δ inhibitor. Hypoxia-induced LDH release was significantly increased by the treatment with rottlerin. We examined the specific blockade of PKC-δ activation by rottlerin after 1 hour of hypoxia in bEnd.3 cells. When pcDNA-PKC δ-WT was transfected into bEnd.3 cells, LDH release and trypan blue positive cells were attenuated during hypoxia. From these results, it is suggested that hypoxia causes an activation of PKC-δ, rendering bEnd.3 cells resistant to hypoxia-induced cell death.

뇌혈관 질환은 혈류를 통한 지속적인 산소 및 포도당 공급이 필요한 국소 뇌조직 대사에 이상을 일으키게 되어 그에 따른 국소 뇌조직의 기능 이상이 임상 증상으로 나타나는 질환이다. 저산소에 의한 세포 사멸과정에는 protein kinase C(PKC)가 관여한다고 알려져 있는데, 세포의 종류에 따라 다르게 작용하는 PKC isotype의 역할이 아직까지 명확하게 밝혀지지 않았고, 조절기전 역시 불분명한 실정이다. 따라서 본 연구에서는 저산소에 의한 뇌혈관 내피세포 사멸과정에서 PKC isotype의 활성 변화 및 역할을 알아보았다. 저산소성 뇌혈관 내피세포 사멸을 유도하기 위하여 Oxygen-Glucose Deprivation (OGD) 모델을 이용하였으며, bEnd.3 뇌혈관 내피세포주를 실험 전 과정에 사용하였다. 저산소 상태에서 PKC-δ의 활성화 변화를 확인하였고 저산소에 의한 세포 사멸과정에서 PKC-δ의 역할을 알아보기 위해 PKC-δ 활성을 억제하거나 PKC-δ를 과발현시켜 세포사멸의 변화를 관찰하였다. 세포사멸의 정도는 lactate dehydrogenase (LDH) 유리, trypan blue 염색 방법을 통해 관찰하였다. bEnd.3 뇌혈관 세포주를 저산소에 노출시킨 지 1 시간째 PKC-δ의 활성 가장 증가하였고 4 시간까지 지속되었다. 저산소에 의한 뇌혈관 내피세포 사멸과정에서 PKC-δ의 역할을 알아보기 위해 PKC-δ 저해제인 rottlerin을 처리한 결과, 저해제의 농도가 증가함에 따라 세포 사멸이 현저히 증가하였으며 저산소 자극 후 PKC-δ 활성이 rottlerin에 의해 감소됨을 확인하였다. 또한, PKC-δ를 과발현 시켰을 때 저산소에 의한 세포사멸이 감소하는 것을 관찰하였다. 이러한 결과들로부터 저산소에 의한 뇌혈관 내피세포 사멸과정에서 활성이 증가된 PKC-δ는 세포사멸로부터 세포를 보호하는 것으로 추정되었다.