Characterization of salivary proteins identified as potential biomarkers for systemic lupus erythematosus through proteomic analysis

Abstract

OBJECTIVES: Systemic lupus erythematosus (SLE) is a heterogeneous autoimmune disease characterized by pathogenic autoantibodies and uncontrolled inflammatory response. There are few reliable biomarkers available for diagnosis and monitoring the disease. We tried to find and characterize specific protein components in saliva of patients with SLE for their use as biomarkers in future. MATERIAL AND METHODS: Salivary proteins were prepared from 11 samples from patients with SLE and healthy controls (HC), and were subjected to 2-dimensional gel electrophoresis (2-DE). The spots with greater than 2 fold change in intensity were identified by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometer (MS) analysis. The relative and absolute amounts of the several candidate proteins in saliva of patients with SLE and rheumatoid arthritis (RA) and HC were analyzed using western blotting and enzyme-linked immunosorbent assay. RESULTS: Proteomic analysis using 2-DE and MS identified 20 differentially expressed protein spots in the saliva of SLE patients compared in that of HC. Among them, proteins with more than two-fold differences in expression were found as immunoglobulin gamma-3 chain C (IGHG3), immunoglobulin alpha-1 chain C region, protein S100, lactotransferrin, leukemia-associated protein 7, and 8-oxoguanine DNA glycosylase. salivary IGHG3 levels were increased in SLE (3.0 ± 1.4 pg/mL) compared to those in RA (1.5 ± 0.7 pg/mL, p < 0.001) or HC (1.2 ± 0.5 pg/mL, p < 0.001), and salivary lactotransferrin levels were increased in SLE (5.0 ± 1.7 pg/mL) compared to those in RA (3.1 ± 1.6 pg/mL, p < 0.001) or HC (2.3 ± 1.7 pg/mL, p < 0.001). Salivary lactotransferrin levels were correlated with complement 3 (r = 0.27, p = 0.01) and complement 4 (r = 0.27, p = 0.02). The follow up study, the patient with increased salivary IGHG3 had significantly different in changes of hemoglobin (-0.85 ± 0.87 vs 0.42 ± 0.99 /μL, p = 0.02) and changes of complement 3 (-7.67 ± 14.15 vs 7.0 ± 9.34, p = 0.02) compared to those not. In addition, the patients with increased salivary lactotransferrin had significantly different in changes of ESR (-2.0 ± 4.6 vs 8.4 ± 9.56, p = 0.02) compared to those not, and salivary lactotransferrin levels negatively correlated with complement 3 levels (r = -0.5, p= 0.02). CONCLUSION: Salivary IGHG3 and lactotransferrin levels were significantly increased in patients with SLE compared to those in patients with RA or HC, and could be used as potential biomarkers of SLE.

서론: 전신홍반루푸스는 자가항체의 생성과 전신에 발생하는 염증반응이 특징적인 자가면역질환으로 다양한 증상 및 질병활성도를 가진다. 전신홍반루푸스의 진단에서 항핵항체의 유무가 중요하지만 질환 특이적인 지표가 없으며 치료 반응을 평가하는데 활용할 수 있는 생물표지자가 부족하다. 타액은 비침습적이고 반복적으로 수집할 수 있는 장점이 있으며 혈액 내 단백이 포함되어 있어 질병의 특징을 연구하는데 유용한 체액이다. 최근 많이 사용되는 단백분석기술을 통해 전신 질환에서 변화된 타액 내 단백 조성의 차이를 정밀하게 분석할 수 있다. 방법: 11명의 전신홍반루푸스와 건강대조군에게서 수집된 타액으로 2차원 전기영동을 시행하였고, 분리된 점들 중 차이를 보이는 것들을 질량분석기를 통해 단백성분을 밝혔다. 웨스턴블랏과 효소결합면역흡착측정법을 통해 전신홍반 루푸스 환자와 류마티스관절염 환자, 건강대조군에게서 제공받은 타액 내 후보 단백성분들의 농도를 측정하였다. 전신홍반루푸스 환자들에게서 1-2년 뒤 다시 타액을 수집하여 타액 내 단백성분의 농도를 측정하여 농도의 차이와 임상 양상의 차이간의 상관성을 분석하였다. 결과: 2차원 전기영동을 시행한 결과에서 전신홍반루푸스와 건강대조군의 타액 내 단백성분 20개의 점들 중 2배 이상 차이를 보이는 점들은 immunoglobulin gamma-3 chain C (IGHG3), Ig alpha-1 chain C region, protein S100, 락토트랜스페린, 8-oxoguanine DNA glycosylase, 그리고 leukemia-associated protein 7 이였다. 타액 내 IGHG3의 농도는 전신홍반 루푸스 환자군 (3.0 ± 1.4 pg/mL)에서 류마티스관절염 환자 (1.5 ± 0.7 pg/mL, p < 0.001) 나 건강대조군(1.2 ± 0.5 pg/mL, p < 0.001)에 비해서 유의하게 높았고, 타액 내 락토트랜스페린의 농도도 전신홍반루푸스 환자군 (5.0 ± 1.7 pg/mL)에서 류마티스관절염 환자군(3.1 ± 1.6 pg/mL, p < 0.001)이나 건강대조군(2.3 ± 1.7 pg/mL, p < 0.001)에 비해서 유의하게 높았다. 타액 내 락토트랜스페린은 전신홍반루푸스 환자들의 보체 3 (r = 0.27, p = 0.01)과 보체 4 (r = 0.27, p = 0.02)와 양의 상관관계가 있었다. 1-2년 후 시행된 추적 연구에서는 타액 내 IGHG3의 농도가 증가된 군은 감소된 군에 비하여 헤모글로빈의 변화량 (-0.85 ± 0.87 vs 0.42 ± 0.99, p = 0.02)과 보체 3 의 변화량 (-7.67 ± 14.15 vs +7.0 ± 9.34, p = 0.02)에서 유의하게 차이를 보였다. 타액 내 락토트랜스페린의 농도가 증가된 군은 감소된 군에 비해 ESR의 변화량 (-2.0 ± 4.6 vs 8.4 ± 9.56, p = 0.02)에서 유의하게 차이를 가졌고, 타액 내 락토트랜스페린의 변화량과 보체 3의 변화량이 음의 상관관계를 보였다 (r = -0.5, p = 0.02). 결론: 타액 내 IGHG3와 락토트랜스페린은 전신홍반루푸스에서 상승되어 있으며, 이는 잠재적인 생화학적 지표로 가능성을 시사한다.