Transcriptomes of CD27-CD28- and CD27+CD28+ CD8+ T subsets disclose differentially expressed novel genes and signaling pathways in Behçet's disease

Abstract

BACKGROUND AND OBJECTIVES: Behçet’s disease (BD) is a chronic inflammatory disease characterized by recurrent mucocutaneous ulceration and other complications such as blindness and large vessel inflammation. Immunosenescence, aging of immune system, is related to increased susceptibility to infectious diseases, vaccine failure, and chronic low grade systemic inflammation. Our previous study showed increased frequency of senescent CD8+ T cells in the peripheral blood of patients with BD. In this study, to find the global genet-expression characteristics of senescent CD8+ T cells in relation with BD, we examined the transcriptome of CD8+ T lymphocyte subsets (CD27-CD28- senescent and CD27+CD28+ nonsenescent) from BD patients and healthy control (HC) subjects. MATERIAL AND METHODS: Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were collected from BD patients (n=18) and HCs (n=18). CD8+ T cells were isolated through CD8 microbeads, and those were labelled with conjugated monoclonal antibodies as follows: FITC anti-CD8, allophycocyanin (APC)-H7 anti-CD27 and APC anti-CD28. Using fluorescence-activated cell sorting (FACS), senescent CD8+ T cells (CD8+CD27-CD28-) and non-senescent CD8+ T cells (CD8+CD27+CD28+) were sorted. After sorting, each group of cells were pooled together and cultured in medium (RPMI 1640). Cells were stimulated with anti-CD3 (500ng/ml, clone OKT3) for 72 hours. Total RNA was extracted from anti-CD3-stimulated cells with the RNA isolation kit. Transcriptome analysis was performed. We analyzed the differentially expressed genes from the four different groups (BD patients vs. controls, senescent CD8+ T cells (CD8+ CD27- CD28-) vs. non-senescent CD8+ T cells (CD8+ CD27+ CD28+)). Differentially expressed genes were submitted to Ingenuity Pathway Analysis (IPA) for functional evaluation and identification of significant biological pathways. For the validation of genes that show large fold change value in transcriptome sequencing, additional five BD patients and five HCs were enrolled to collect RNA and perform the real-time PCR on eight genes. RESULTS: Differentially expressed 1103 genes were identified in BD CD27-CD28- subsets compared to HC, while 652 genes were differentially expressed in BD CD27+CD28+ subsets compared to HC. As a result of the real-time PCR, COL5A1, ARHGEF10 showed the same tendency with the transcriptome analysis in the BD CD27-CD28- subsets compared to HCs, among which the statistical significance was shown in COL5A1. Meanwhile, TRPV3, ARHGEF10, UBE2F-SCLY, CD302, and SHANK1 showed the same tendency with the transcriptome analysis in the BD CD27+CD28+ subsets compared to HCs, and the statistical significance was found in TRPV3 and ARHGEF10. Of the significant canonical pathways identified in IPA, 11 pathways showed activity in the opposite direction between CD27+CD28+ and CD27-CD28- subsets, while two pathways tended to be same. The most significant canonical pathway resulted from the IPA was the cAMP-mediated signaling. CONCLUSION: This is the first study for transcriptome analysis of CD8+ T cells of BD patients compared to HCs. This study was also the first to separate senescent CD8+ T cells and non-senescent CD8+ T cells to perform RNA sequencing, respectively. Transcriptome analysis found differentially expressed genes in patients with BD. And IPA suggested the pathways in which these differences in gene expression may be involved in the pathogenesis of BD. Using these differentially expressed genes may be useful for developing biomarkers in BD that can predict the treatment response as well as help diagnosing easily. Consequently, we hope that this genetic profiling can be used as a key for approaching the pathogenesis of BD.

연구배경: 베체트병은 점막과 피부, 혈관, 눈, 신경 및 기타 여러 주요 장기들을 침범할 수 있는 임상증상을 가지는 만성 재발성 전신 질환이다. 면역노화는 면역계에 노화현상이 발생하며 나타나는 변화로, 감염성 질환에 취약해지고 백신 접종 시 면역획득에 실패하거나, 지속적인 만성 염증 증세를 보이는 것 등과 관련이 있다. 본 연구진의 선행 연구에서 베체트병 환자의 말초혈액에서 노화 CD8+ T세포의 빈도 증가를 확인한 바 있다. 연구목적: 따라서 본 연구에서는 베체트병 환자 군과 정상 대조군의 말초혈액 내 단핵세포를 노화(CD27-CD28-) 그리고 비노화(CD27+CD28+) CD8+ T세포 그룹으로 나눈 뒤, 전사체 분석을 시행하여 이들의 유전자 발현 특성을 확인하고자 하였다. 연구방법: 18명의 베체트병 환자 군과 연령 일치된 정상대조군 18명을 대상으로 말초혈 단핵세포를 분리하였다. CD8 마이크로비드(microbead)로 CD8+ T세포만 분리한 후 면역결합 단세포 항체를 이용하여 CD8, CD27, CD28을 표지 하였고, Fluorescence-activated cell sorting(FACS)를 이용하여 노화 CD8+ T세포(CD8+CD27-CD28-)와 비노화 CD8+ T세포(CD8+CD27+CD28+)로 분리하였다. 환자들로부터 분리된 세포들은 함께 모아 RPMI 1640 배지에 배양하였고 이후 anti-CD3으로 자극하였다. 자극된 세포들로부터 RNA isolation kit를 사용하여 RNA들을 추출하였고, 이를 Macrogen 사에 의뢰하여 전사체 분석을 시행하였다. 베체트병 환자와 정상대조군, 노화세포와 비노화세포 여부에 따른 네 가지 그룹으로 나누어 차별발현유전자(Differentially expressed genes)를 분석하였다. 차별발현유전자들은 Ingenuity Pathway Analysis(IPA)를 통해 분석하여 기능적 주석과 주요 생물학적 경로 및 상위조절인자를 확인하였다. 또한 본 전사체 분석의 유효성을 확인하기 위하여, 환자와 정상인 간에 큰 폭의 차이를 보인 유전자들을 대상으로 환자와 정상대조군을 각 5명씩 추가 등록하여 실시간 Polymerase chain reaction(PCR)을 시행하였다. 연구결과: 노화세포 군에서 베체트병 환자의 차별발현유전자는 1103개였으며, 비노화세포 군에서는 652개였다. 이 결과에 대한 유효성 평가를 위하여 시행한 상위 차별발현유전자들 중에 서 노화세포 군에서는 COL5A1, ARHGEF10, 그리고 LOC102724428이 전사체 분석의 결과와 같은 경향성을 보였고 그 중 COL5A1에서는 환자와 정상대조군 사이에 통계적으로 유의한 차이를 확인할 수 있었다. 한편 비노화세포 군에서는 TRPV3, ARHGEF10, UBE2F-SCLY, CD302, SHANK1이 전사체 분석 결과와 같은 경향성을 보였고, 그 중 TRPV3과 ARHGEF10은 환자와 정상대조군 사이에 통계적으로 유의한 차이를 보였다. IPA를 통해 확인된 주요 canonical 경로에서, 11개의 경로가 서로 반대의 활성을 보였으며 2개의 경로에서는 같은 방향의 활성을 보였다. 가장 주요한 canonical 경로로 확인된 것은 cAMP-매개 신호전달 경로였다. 결론: 본 연구는 베체트병과 환자간의 차별발현유전자를 확인 시켜 주었다. 또한 IPA를 이용한 접근법은 베체트병의 병인기전과 관련되어 있을 가능성이 있는 경로들을 제시하였다. 본 연구에서 확인된 차별발현유전자들을 이용하여 베체트병 환자 진단에 유용한 바이오마커(biomarker) 개발을 시행한다면, 아직 객관화 되지 않은 베체트병 진단을 보다 쉽고 간단하게 하며, 치료반응성을 예측하는 데에도 도움이 될 것으로 기대한다.