Structural and Functional Properties of the Recombinant anti-KIFC1 Antibodies Expressed in the Cytosol

Abstract

Intrabodies, antibodies expressed in cells, are widely used in the life science field to regulate the function of intracellular antigens. Most of studies about intrabodies expressed in the cytosol have been performed on single-chain variable fragment (scFv) or single domain antibodies containing few disulfide bonds and simple structure. Because it is known that the disulfide bond is hardly formed in the reducing condition of the cytosol, the antigen-binding site may not be properly formed when the complex structure of immunoglobulin G (IgG) is expressed in the cytosol. In this study, IgG was expressed in the cytosol for the first time to increase the utilization of cytosolically expressed antibody. First, in order to confirm the effect of the variable region on the activity of the cytosolic IgG intrabodies, three anti-KIFC1 (kinesin family C1) IgGs and one anti-nucleic acid IgG that consist of the same human-derived constant regions and different mouse-derived variable regions were expressed in the cytosol. Analysis of the cytosolic IgG intrabodies revealed that the antigen-binding activity and the association of heavy and light chains were different according to the variable region sequence. In order to investigate the effect of the constant region folding on the characteristics of the cytosolic IgG intrabodies, cysteine residues in the constant regions were replaced with serine residues to inhibit formation of inter- and intra-chain disulfide bonds. The results suggested that integrity of the constant region affects formation of antigen-binding site of the variable region. It was also observed that the heavy and light chains were not associated in the absence of intra-chain disulfide bond of constant region. The presence of the disulfide bonds in cytosolic IgG intrabody was confirmed by direct PEGylation of cysteine residues. We also compared the re-folding of fully reduced ER-directed IgG and cytosolic IgG intrabody. It was confirmed that even if the protein had completely the same amino acid sequence, it was folded differently depending on the location of expression. In the case of scFv form of cytosolic 6C407 and 2C281, they retained its antigen-binding activity in the scFv form as well as IgG form. Further, cytosolic 6C407 scFv expression increased multipolar spindle formation and prolonged mitotic duration, suggesting that 6C407 scFv inhibits centrosome clustering function of KIFC1. This study is expected to contribute to the understanding of the structural and functional properties of cytosolically expressed antibodies.

세포내 항체(intrabody)는 세포 안에서 발현되는 항체로서 세포내 항원의 기능을 조절하기 위하여 생명과학분야에서 널리 활용되고 있다. 세포질에서 발현되는 항체에 대한 연구는 대부분 이황화 결합의 수가 적고 구조가 단순한 단일가닥 항체(singlechain variable fragment, scFv)나 단일도메인 항체(single domain antibody)를 대상으로 수행되어 왔다. 그 이유는 환원환경인 세포질에서는 이황화 결합이 형성되지 않아 복잡한 구조를 지닌 면역글로불린 G(immunoglobulin G)를 발현할 경우 항원결합 부위가 제대로 만들어지지 않을 것으로 여겨지고 있기 때문이다. 본 연구에서는 세포질발현 항체의 활용가능성을 높이기 위해 최초로 세포질에 IgG 를 발현하여 구조적 특징을 확인하였고 세포질 scFv 항체의 항원억제 기능을 관찰하였다. 먼저 세포질발현 IgG 의 활성에 가변부위가 미치는 영향을 확인하고자 동일한 인간 유래 불변부위와 각기 다른 쥐 유래 가변부위로 이루어진 3 종의 항-KIFC1(kinesin family C1) IgG 와 1 종의 항-핵산 IgG 를 세포질에 발현하였고, 분석 결과 세포질발현 IgG 의 항원결합 능력 및 중쇄-경쇄 간 조합은 가변부위 서열에 따라 다르게 나타났다. 세포질발현 IgG 의 특성에 있어서 불변부위의 접힘이 미치는 영향을 확인하고자 불변부위 내의 시스테인 잔기를 세린으로 치환하였다. 그 결과 세포질발현 IgG 의 쇄간(inter-chain) 및 쇄내(intra-chain) 이황화 결합이 형성되지 않아 불변부위가 비정상적으로 접힌 경우 항원결합 부위가 제대로 형성되지 않았다. 불변부위로만 이루어진 항체의 이황화 결합 형성을 억제한 경우에는 쇄내 이황화 결합 없이는 중쇄-경쇄 간 조합이 관찰되지 않았으며 이황화 결합을 이루는 시스테인 잔기를 직접 PEGylation 함으로써 세포질발현 IgG 내에 이황화 결합이 부분적으로 존재하는 것을 확인하였다. 또한 소포체발현 IgG 와 세포질발현 IgG 를 완전히 환원한 후 재접힘 되는 방식을 비교한 결과 완전히 동일한 아미노산 서열을 지니고 있음에도 불구하고 발현된 장소에 따라 다르게 접힘을 알 수 있었다. 세포질에 발현되었을 때 항원결합 능력을 지녔던 6C407 IgG 와 2C281 IgG 는 scFv 형태로 세포질발현 된 경우에도 항원결합 능력을 보였다. 뿐만 아니라, 6C407 scFv 를 세포질에 발현시켰을 때, 분열기세포에서 다극성 스핀들(multipolar spindle) 형성이 증가하고 유사분열 시간(mitotic duration)이 길어지는 현상이 관찰되었다. 이는 6C407 scFv 이 세포 내에서 KIFC1 과 결합하여 중심체 군집기능을 억제했음을 의미한다. 본 연구는 세포질발현 항체의 구조 및 기능적 특성에 대한 이해를 높이는 데에 기여할 것으로 보인다.