Effects of Sirtuin 2 on Hepatitis B Virus Replication

Abstract

Sirtuin 2 (Sirt2), a NAD+-dependent protein deacetylase, is overexpressed in many hepatocellular carcinomas (HCCs) and can deacetylate many proteins, including tubulins and AKT prior to AKT activation. Here, we found that endogenous Sirt2 was upregulated in hepatitis B virus (HBV) WT-replicating cells, leading to tubulin deacetylation; however, this was not the case in HBV replication-deficient mutant-transfected cells and 1.3mer HBV WT-transfected plus reverse transcriptase inhibitor (entecavir or lamivudine) treated cells but all HBV proteins are expressed. In HBV WT-replicating cells, upregulation of Sirt2 induced AKT activation, which consequently downregulated glycogen synthase kinase (GSK-3β) and increased β-catenin levels; however, downregulation of Sirt2 in HBV non-replicating cells impaired AKT/GSK-3β/β-catenin signaling. Overexpression of Sirt2 isoform 1 stimulated HBV transcription and consequently HBV DNA synthesis, which in turn activates AKT and consequently increases β-catenin levels, possibly through physical interactions with Sirt2 and AKT. Knockdown of Sirt2 by shRNAs or inhibition by AGK2 or dominant-negative mutant expression inhibited HBV replication, reduced AKT activation, and decreased β-catenin levels. The deacetylase inactive isoform 5 of Sirt2 (Sirt2.5) also showed inhibited HBV replication from transcription and failed to activate AKT/GSK-3β/β-catenin signaling. Both the Sirt2.1 and Sirt2.5 are recruited to cccDNA but Sirt2.5 showed more recruitment. Through HBV infection, we demonstrated that Sirt2 knockdown inhibited HBV replication from transcription. Although HBx itself activates AKT and upregulates β-catenin, Sirt2-mediated signaling and upregulated HBV replication were HBx-independent. Since constitutively active AKT inhibits HBV replication, the results suggest that upregulated Sirt2 and activated AKT may balance HBV replication to prolong viral replication, eventually leading to development of HCC. Also, the results indicate that Sirt2 inhibition may be a new therapeutic option for controlling HBV infection and preventing HCC.

NAD + 의존 단백질 탈아세틸화 효소인 Sirtuin 2(Sirt2)는 많은 간세포암 (hepatocellular carcinoma, HCC)에서 과발현되며, tubulin 과 AKT 를 포함한 많은 단백질을 탈아세틸화할 수 있다. AKT 활성화 과정에서 AKT 탈아세틸화가 중요하다. B 형 간염 바이러스(hepatitis B virus, HBV)가 증식하는 세포에서 Sirt2 발현이 증가되어 있으며 이에 따라서 Sirt2 의 기질 중 하나인 tubulin 이 탈아세틸화 됨을 발견했다. 그러나 모든 HBV 단백질이 발현된 HBV 복제가 결핍된 돌연변이체로 트랜스펙션한 세포와 1.3mer 의 HBV WT 로 트랜스펙션한 후, 역전사 효소 억제제(엔테카비어 또는 라미부딘)를 처리한 세포에서는 Sirt2 발현이 감소되었다. HBV WT 복제 세포에서 Sirt2 발현 조절은 AKT 활성화를 유도하여 결과적으로 글리코겐 합성 인산화효소(glycogen synthase kinase 3 beta, GSK-3β)를 억제하여 β-카테닌(β-catenin) 발현 양을 증가시켰다. 그러나 HBV 가 증식하지 않는(복제 결손 돌연변이 또는 역전사 효소 억제제 처리)세포에서 Sirt2 를 통한 AKT/GSK-3β/β-catenin 신호전달과정이 손상되어 있었다. Sirt2 isoform 1 의 과발현은 HBV 전사를 촉진하여 결과적으로 HBV DNA 복제가 촉진되며 이때 Sirt2 및 AKT 와 물리적으로 상호작용하여 AKT 가 활성화되고 β-카테닌 양을 증가시킨다. shRNA 에 의한 Sirt2 의 녹다운 또는 AGK2 에 의한 Sirt2 억제 또는 Sirt2 도미넌트 네가티브 돌연변이체를 발현시키면 HBV 복제가 억제되고, AKT 활성화가 감소되며, β-카테닌 양이 감소되었다. 반면에 Sirt2 isoform 5 (Sirt2.5)는 HBV 전사를 억제하여 HBV 복제를 억제하고 AKT/GSK-3β /β-catenin 신호 전달을 활성화시키지 못했다. Sirt2.1 과 Sirt2.5 는 모두 cccDNA 에 결합되었지만 Sirt2.5 는 더 많은 결합을 보였다. Sirt2 녹다운이 HBV 복제를 전사로부터 저해한다는 것을 HBV 감염 실험을 통해 증명했다. HBx 자체가 AKT 를 활성화시키고 β-카테닌이 증가되도록 조절하지만, Sirt2 를 통한 AKT/GSK-3β/β-catenin 신호전달과정과 HBV 증식조절은 HBx 와는 독립적이다. 항상 활성화 상태 돌연변이 AKT 가 HBV 복제를 억제하기 때문에, 본 연구 결과는 발현이 증가된 Sirt2 및 활성화된 AKT 를 통해 적정선의 HBV 증식이 되어 궁극적으로는HCC의 발생으로 이어진다. 또한 Sirt2 억제가 HBV 감염을 조절하고 HCC 를 예방하기위한 새로운 치료적 선택 일 수도 있음을 제시한다.