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Nuclear accumulation of G-actin in cellular senescence: Reduced expressions of exportin 6 and Ran small G protein

Other Title
세포노화 과정 중 G-actin의 핵 내 축적: Exportin 6와 Ran-GTP의 발현 및 분포변화
Authors
박, 수현
Degree
Master (2008)
Abstract
Actin is a highly conserved, ubiquitous cytoskeletal protein, which contains two leucine-rich nuclear export signal (NES) sequences in the middle of the molecule. It has been known that actin is exclusively kept in the cytoplasm by exportin 1 (CRM1)-driven nuclear export. However, CRM1 has been reported to be not directly involved in actin export from vertebrate or Drosophila nuclei. On the other hand, exportin 6 (exp6) has been found as a novel family member from higher eukaryotes. Exp6 mediates nuclear export of profilin-actin complexes. We earlier reported that actin was accumulated in nucleus during replicative senescence of human diploid fibroblast (HDF). In the present study, we found that the increase of doubling time of HDF cells decreased exp6 and Ran expression as well as phosphorylated cofilin. Concurrently, Ran was transported into the cytoplasm. We attempted to determine possible involvement of exp6 in the regulation of actin accumulation in nuclei, by employing H₂O₂-induced senescent model. Exp6 and Ran expressions were not changed and Ran was localized in cytoplasm. Phosphorylated cofilin was decreased in induced senescent cells. These results suggest that exp6, Ran and cofilin are involved in the regulation of actin accumulation in nuclei during cellular senescence.

"목적: Actin은 대부분의 세포에 존재하는 단백질로써 세포질과 핵을 이동하면서 각각 특정한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 세포질에서는 cytoskelecton 으로서의 역할이 대표적으로 알려져 있으며 핵에서의 역할에는 여러 가지가 보고되고 있지만 그 중에 전사를 조절하는 요소로써 작용하는 역할이 중요하고 흥미롭다고 생각 되고 있다. 이러한 actin이 활성산소나 열 자극과 같은 외부적인 스트레스에 의해서 핵으로 이동하는 현상이 여러 곳에서 보고된바 있고 노화가 진행되는 세포에서도 actin이 핵으로 이동해서 축적되는 현상을 관찰하였다. 지금까지 actin이 핵과 세포질로 이동하는데 관여하는 단백질에 대해 보고된 바에 의하면 actin을 핵으로 들여보내기 위한 역할을 하는 단백질에는 cofilin이 알려져 있고, 핵 내 actin을 세포질로 이동시키는 역할은 CRM1이 한다고 알려져 있다. 그러나, exportin 6라는 새로운 단백질이 보고되고 이것 또한 actin을 핵 내에서 세포질로 이동시키는 역할을 한다고 보고된 바 있으며, 이 단백질을 발견한 그룹에서는 actin을 세포질로 이동시키는데 CRM1의 작용은 관찰하지 못했다고 보고하였다. 따라서 CRM1보다는 exportin- 6가 actin을 세포질로 이동시키는 역할을 한다는 내용이 보편적으로 받아들여지고 있는 실정이다. 본 실험에서는 노화가 진행될 때 actin이 핵에 축적되는 현상의 기전을 actin의 import와 export차원에서 관여하는 단백질들의 나타나는 변화를 알아보고자 하였다. 재료 및 방법: HDF 젊은 세포를 계대배양하면서 replicative senescence를 유도하고, 200 μM H₂O₂의 농도로 한번 처리하여 조기노화 세포를 만들었다. 세포노화의 진행정도는 Senescence associated-β-galactosidase assay (SA-β-gal)와 세포성장율 측정으로 보고하였다. Actin, Ran그리고 exportin 6의 단백질 발현과 세포 내 위치변화는 western blot과 면역형광염색을 수행하여 측정하였다. 세포 내 exportin 6의 mRNA발현양은 RT-PCR로 측정하였으며 Exportin 6와 actin과의 결합을 보기 위해서 flag-exp6 발현 벡터를 제작해 이를 transfection 하여 immunoprecipitation의 수행으로 측정하였다. 결과: 1. HDF 젊은 세포를 계대배양으로 노화된 세포에서 SA-β-gal 활성이 증가하고, 세포성장율이 떨어지는 것을 관찰할 수 있었고, 세포노화표지자인SA-p-Erk1/2와 p53의 발현이 HDF 노화 세포에서 증가하는 것을 관찰하였다. 2. 젊은 세포와 노화된 세포의 세포질과 핵을 별도로 분리하여 western blot으로 관찰한 결과 노화 세포의 핵 분획에서 actin발현이 증가하는 것을 관찰하였고 immunocytochemistry를 통해서도 노화된 세포에서 actin이 핵에 축적되어 있는 것을 관찰 하였다. 3. 젊은 세포에서나 노화 세포에서 cofilin의 발현은 차이가 없으나 p-cofilin 발현 감소하는 것을 관찰 하였다. 또한 노화 세포의 핵 분획에서 cofilin이 증가하는 것을 관찰하였다. 4. Exportin 6 발현 벡터를 제작해 Huh7 와 NIH3T3 세포에transfection해서 actin과의 결합여부를 확인한 결과 상호 결합하는 것을 확인하였다. 5. 노화된 세포에서 exportin 6의 mRNA 그리고 protein발현이 감소하는 것을 관찰하였다. 6. 노화된 세포에서 Ran의 발현이 감소하는 것을 관찰하였다. 7. 젊은 세포의 핵에 존재하던 Ran 단백질이 노화 세포에서는 모두 세포질에서 관찰되었다. 8. H₂O₂를 한번 처리한 후 5일 동안 배양하여 노화를 유도시켰다는 것을 SA-β-gal 실험을 통해 관찰하였다. 하지만 활성화 정도가 약하게 관찰되어 노화가 약하게 유도되었다고 예상할 수 있었다. 9. 노화를 유도시킨 세포에서exportin 6와 Ran의 발현차이는 관찰되지 않았으나 p-cofilin의 발현은 감소되는 것을 관찰하였다. 10. 노화 세포와 같이 유도 노화 세포에서도 Ran단백질 발현은 핵보다 세포질에서 크게 증가하는 것을 관찰하였다. 결론: HDF 젊은 세포를 계대배양으로 노화시키는 경우 노화가 진행되었음을 여러 가지 노화표지자로 측정하였고, 이러한 세포에서 actin의 위치가 핵에 존재한다는 것을 면역형광염색법과 세포질과 핵 분획을 통해서 확인하였다. 그리고 actin을 핵으로 들여보낸다고 알려진cofilin의 인산화 정도를 관찰한 결과 노화 세포에서 cofilin인산화가 감소되는 것을 알 수 있었지만 cofilin의 발현에는 변화가 없었다. 또한 cofilin의 위치를 알아보기 위해 세포질과 핵 분획으로 나누어 cofilin의 위치변화를 보았는데 노화 세포의 핵 내에서 cofilin이 증가하는 것을 관찰함으로써 노화가 진행되면 cofilin의 활성화가 높아져 G-actin이 많아지고 cofilin이 더 많은 actin을 핵으로 들여보낼 것이라는 결론은 얻게 되었다. Actin을 세포질로 내보낸다고 알려진 exportin 6 가 actin과 결합하는 것을 확인한 후 노화 세포에서 발현을 관찰하였더니 mRNA와 단백질 발현이 의미있게 감소하는 것을 관찰했다. 또한 exportin 6가 actin을 세포질로 이동시키는데 중요한 요소로 작용하는 Ran의 위치변화를 관찰한 결과 젊은 세포에서는 핵에 많이 존재했던 Ran이 노화 세포에서는 세포질로 이동하는 것을 관찰하였으며 Ran의 단백질발현 또한 감소하는 것을 관찰하였다. 이 결과로 노화가 진행되면 exportin 6의 발현감소로 인해 actin과 결합하는 비율이 줄고 세포질에 있는 Ran의 증가로 exportin 6의 기능 또한 저하될 것이라 예상할 수 있다. 노화 세포에서 발견된 현상들이 유도 노화 세포에서도 동일하게 관찰되는지 알아보기 위해 H₂O₂를 한 번 처리한 후 5일 동안 배양하여 세포 노화를 유도하였다. 이때, SA-β-gal 발현이 증가 했으며 이 때 exportin 6와 Ran의 발현변화, cofilin 의 인산화 정도 그리고 Ran의 위치변화를 관찰하였다. 그 결과 노화가 유도된 세포에서cofilin의 인산화 정도가 감소하는 현상을 관찰하였고 Ran의 위치가 세포질로 변하는 것을 관찰했으나 exportin 6와 Ran의 발현이 감소하는 현상은 관찰되지 않았다. 그 이유는 노화가 유도된 세포가SA-β-gal에 약하게 염색되었는데 이는 노화가 약하게 유도되었다는 것을 예상할 수 있으며 따라서 노화가 더 진행되면 exportin 6와 Ran의 발현이 감소할 것이라 예상된다. 결과적으로, 노화된 세포에서 actin이 핵에 축적되는 이유는 cofilin의 활성화가 증가되어 actin을 더욱 핵으로 많이 들여보내고 반면에 exportin 6의 발현감소로 인해 actin과 결합해 세포질로 내보내는 확률이 낮아지고 Ran이 세포질로 이동하면서 활성이 저하되어 actin과 결합된 exportin 6가 세포질로 나가는 기능이 억제되기 때문이라는 추정을 할 수 있다."
Keywords
Exportin 6actinRan
Appears in Collections:
Theses > School of Medicine / Graduate School of Medicine > Master
AJOU Authors
박수현
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