Genetic Polymorphisms of Interleukin-6 in Systemic Lupus Erythematosus

Abstract

BACKGROUNDS: Systemic lupus erythematosus (SLE) is an autoimmune disease characterized by polyclonal B-cell activation and elevated production of pathogenic autoantibodies. Interleukin-6 (IL-6) is a multifunctional cytokine that mediates inflammatory and immune responses, and IL-6 gene polymorphisms are known to play a part in chronic inflammatory and autoimmune disorders. We have identified single nucleotide polymorphisms (SNPs) in the IL-6 gene, determined their frequency in Korean populations, and elucidated their difference between SLE patients and controls. MATERIALS AND METHODS: Blood samples were collected from Korean SLE patients (n=151) and normal healthy controls (n=151) from the rheumatology clinic at the Ajou University Hospital. All of patients fulfilled the American College of Rheumatology (ACR) classification criteria for SLE. Genomic DNA was extracted and approximately 1.4 kb-sized IL-6 genes located between promoter region and exon2 region were amplified by polymerase chain reaction (PCR). We identified possible polymorphisms in the IL-6 gene and that were genotyped by direct sequencing. Also IL-6 genes located variable number of tandem repeat (VNTR) of 3′flanking region were amplified by PCR and that were genotyped by Genescan analysis. The effect of -276 A>C polymorphism on the promoter activity was analyzed by luciferase reporter assay in Hep3B cell and HeLa cell. Statistical analyses were undertaken using SPSS ver.11.5 P values of <0.05 were considered to be significant. RESULTS: We have identified six SNPs (-572 C>G, -373 AnTn, -276 A>C, -174 A>C in the promoter region, and 331 T>G and 334 A>T in the exon2 region) including three novel SNPs (-276 A>C, 331 T>G and 334 A>T), in the IL-6 gene. There was significant difference in the -373 A10T11 polymorphism (p<0.001) -276 A>C polymorphism (p=0.041), 334 A>T polymorphism (p=0.001) between SLE and normal controls, and no association in other SNPs. Another interesting finding was that there was no C allele of -174 G>C polymorphisms in Koreans. Also genotype of -373 AnTn and major allele of -572 C>G was differented from other ethnic groups. The -572 C>G polymorphism was statistically significantly associated with anti-ds DNA (p=0.007). The -276 A>C polymorphism was statistically significantly associated with thrombocytopenia (p=0.006). We have identified fifteen size VNTR polymorphisms in the 3′flanking region. VNTR I (642 bp) allele was associated with susceptibility of SLE, however VNTR N (652 bp)decreased susceptibility of SLE. Also, VNTR I allele was statistically significantly associated with leukopenia (p=0.048), thrombocytopenia (p=0.020) and C-reactive protein (p=0.019), and VNTR G allele was statistically significantly associated with lymphopenia (p<0.001) and hypocomplementemia (p=0.040). When the carrying of the -174 C, -373 A10T11 and VNTR I (642 bp) alleles were supposed that these alleles were significantly higher disease susceptibility of SLE. Promoter reporter construct carrying the -276 C allele displayed significantly higher promoter activity than that with the -276 A allele (p<0.001) CONCLUSIONS: These data suggest that genetic polymorphisms within IL-6 gene may be associated with disease susceptibility and phenotype of SLE in Koreans. Specially -276 A>C polymorphism within IL-6 promoter region may involve in regulation of IL-6 expression.

목적: 전신성 홍반성 루푸스(systemic lupus erythematosus, SLE)는 만성적인 염증에 의해서 여러 조직 특히 피부, 관절, 혈액, 신장 등이 파괴되는 임상적 특성을 동반하고 면역학적 관용의 소실에 의해 다양한 자가 항체를 생성하는 비정상적인 면역반응이 유도되는 전신적인 자가 면역 질환이다. Interleukin-6 (IL-6)는 여러 가지 기능을 가지고 있는 사이토카인으로 염증 반응과 면역 반응을 매개하며, IL-6 유전자의 다형성은 만성염증과 자가 면역 질환에 관련이 있는 것으로 알려져 있다. 특히 기존의 연구들은 거의 서양인을 대상으로 한 연구인데, 인종에 따라 유전자의 발병에서의 역할에 차이가 있을 수 있고, 한국인 전신성 홍반성 루푸스의 발병에 관여하는 유전자는 서양인과 다를 수 있으므로 한국인을 대상으로 한 유전자 연구가 매우 필요하다고 할 수 있겠다. 이에 본 연구자는 한국인 전신성 홍반성 루푸스에서 IL-6 유전자 다형성을 밝히고, IL-6 유전자의 발현이상이 전신성 홍반성 루푸스의 병인기전과 표현형에도 관여할 것이라는 가정 하에 IL-6 유전자의 전사조절(promoter) 부위와 엑손2(exon2) 부위의 단일염기다형성 및 3′flanking region 의 variable number of tandem repeat (VNTR) 유전자형에 대하여 밝히고자 하였다. 재료 및 방법: 아주대학교 병원 류마티스 내과에 내원한 151명의 전신성 홍반성 루푸스 환자와 대조군으로 류마티스 질환의 기왕력이 없는 151명의 정상인을 대상으로 연구를 수행하였으며, 이들로부터 전혈을 채취한 뒤 genomic DNA를 추출하였다. 전사조절 부위와 엑손2 부위는 약 1.4kb 크기의 IL-6 유전자를 중합효소연쇄반응을 이용하여 증폭하여 직접염기서열 분석을 통하여 다형성을 확인하였고, 3′flanking region의 VNTR 유전자형은 중합효소연쇄반응을 실시한 후 genescan 분석을 통하여 확인하였으며, minor allele의 빈도가 최소 5% 이상인 것을 다형성으로 정의하였다. 또한 -276 A>C 다형성의 유전자형에 따른 전사조절 부위의 활성 정도를 비교하기 위해 promoter activity assay를 시행하였다. 결과: IL-6 유전자의 전사조절 부위에서 -572 C>G, -373 AnTn, -276 A>C, -174 A>C 엑손2 부위에서 331 T>G, 334 A>T 등 총 6개의 유전자형을 결정하였고, 이 중 3개는 보고 된 바 없는 새로운 다형성 이었다. 탐색한 다형성의 유전자형을 결정하여 백인 그룹과의 minor allele 빈도를 조사해본 결과 모든 다형성에서 빈도의 차이를 보였다. 특히 한국인에서 -572 C>G의 다형성은 백인과 다르게 C가 major allele로 나타났고, -373 AnTn 다형성은 서양인에서 발견되었던 4가지 유전자형 중 -373 A8T12은 확인 되지 않았고, 한국인에서는 -373 A9T11, -373 A10T10, -373 A10T11 등의 3가지 유전자형이 확인 되었으며, 외국인에서 가장 많이 보고 되었던 -174 G>C는 minor allele이 5% 미만으로 다형성이 아님을 확인하였다. 또한 전신성 홍반성 루푸스와 정상 대조군 간의 빈도 차이를 분석한 결과 -276 A>C 다형성에서는 정상 대조군에 비해 루푸스 환자군에서 C 유전자형이 높게 나타났고, -373 AnTn 다형성에서는 -373 A10T11 유전자형이 정상 대조군에 비해 높게 나타났다. 그리고 -373 A10T10 유전자형을 가지지 않은 경우에(-373 A9T11 또는 -373 A10T11) 루푸스의 위험도가 증가하였는데, 이것은 아마도 -373 A10T11이 포함되어 있기 때문이라 생각되며, -373 A10T11이 전신성 홍반성 루푸스와 관련이 높은 것으로 추측 되어 진다. 이들 다형성과 루푸스의 임상적 특징과의 관계를 살펴본 결과 -572 C>G 다형성은 anti-ds DNA의 빈도가 유의한 상관관계를 나타내었고, -276 A>C 다형성은 혈소판 감소증(thrombocytopenia)과 유의한 상관관계를 나타내었다. 또한 3′flanking region의 VNTR 부위에서 genescan 분석을 실시함으로써 지금까지의 다른 연구 결과보다 다양한 15개의 alleles을 발견하였다. 특히 루푸스 환자군과 정상 대조군 간의 빈도 차이를 살펴본 결과 VNTR I (642 bp)는 루푸스의 감수성을 증가시키나 VNTR N(599 bp)은 루푸스의 감수성을 감소시키는 것으로 추측되며, VNTR 부위의 다형성과 임상적 특징과의 관계를 살펴본 결과 VNTR I 유전자형(642 bp)은 백혈구 감소증(leukopenia), 혈소판 감소증(thrombocytopenia), C-반응 단백(C-reactive protein)과 통계적으로 유의한 차이를 보였고, VNTR G 유전자형(652 bp)은 림프구 감소증(lymphopenia)과 저보체혈증(hypocomplementemia)에서 통계적으로 유의한 차이를 나타내었다. 이 중 전신성 홍반성 루푸스와 정상 대조군 간의 빈도와 임상적 특징에서도 유의한 결과를 보였던 IL-6 유전자의 전사조절 부위에 존재하는 -276 A>C 다형성을 대상으로 Hep3B cell과 HeLa cell에서 promoter activity assay를 시행한 결과 minor allele인 C 유전자형을 가진 promoter reporter construct에서 major allele인 A 유전자형을 가진 promoter reporter construct보다 전사조절 부위의 활성이 유의하게 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 결론: 따라서 IL-6 유전자의 다형성의 종류와 빈도는 인종간의 차이가 분명히 존재하며, 한국인에서 IL-6 유전자의 다형성(-276 A>C, -373 AnTn, VNTR)은 전신성 홍반성 루푸스에서 질병의 표현형과 감수성에 연관이 있는 것으로 생각되어진다. 특히 한국인에서 IL-6 유전자의 -276 A>C 다형성은 IL-6 유전자의 발현을 조절하여 C 유전자형을 가지고 있을 때 IL-6 유전자의 발현이 증가되어 전신성 홍반성 루푸스로의 발병 가능성을 높이는 것으로 추측된다.