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Biochemical and Cellular Analysis of the Function of Complex Ⅱ in Regulation of Cell Division Cycle

DC Field Value Language
dc.contributor.author변, 해옥-
dc.date.accessioned2020-03-19T07:27:31Z-
dc.date.available2020-03-19T07:27:31Z-
dc.date.issued2004-
dc.identifier.urihttp://repository.ajou.ac.kr/handle/201003/18469-
dc.description.abstractIn aerobically growing cells, mitochondria play a pivotal role as ATP generator through oxidative phosphorylation. Inhibition of the mitochondrial respiratory activity by specific inhibitors such as rotenone, antimycin A, and KCN has often been reported to induce cell death in several cell lines, However, the effect of complex II inhibition on cellular fate has not been well-documented in the present study, we investigated the effect of 2-thenoyltrifluoroacetone(TTFA), a specific complex II inhibitor, on cellular growth and cell cycle of Chang cells, an immortalized human hepatocyte cell line, and further examined the underlying mechanism involved. Under asynchronous condition, TTFA suppressed the cellular growth and eventually induced cell death, but did not change the cell cycle pattern. However, when applied TTFA to the cells synchronized at the late G1 phase by double-thymidine treatment, we found that the time for each phases of the cycle(G1, S, and G2/M) became 1.6 fold longer, thereby delaying the overall cell cycle progression. The delay of cell cycle progression was not due to dysregulated ATP production by TTFA. However, we observed that early production of reactive oxygen species and related redox change of cellular glutathione were accompanied, implying their potential involvement in delaying cell cycle progression.-
dc.description.abstract목적: 세포내 소기관인 미토콘드리아는 기능적으로 세포가 요구하는 에너지의 대부분을 생산하는 주요기관이자 세포내 신호전달 매개체인 활성산소의 생성과 apoptotic 신호 개시자인 'cytochrome c 방출'의 조절장소로서 기능을 하고 있다. 본 연구에서는 '산화적 인산화 과정'에 속해 있는 효소 중 complex Ⅱ의 활성 억제에 의해서 세포의 성장 및 세포주기에 미치는 현상과 기전을 분석함으로서 complex Ⅱ를 매개로 한 세포성장 조절 기전을 이해하려고 한다.
방법 및 재료: Complex Ⅱ의 억제효과를 유도하기 위해 complex Ⅱ의 활성을 특이적으로 억제하는 2-thenoyltrifluoroacetone(TTFA)을 사용하였다. 세포 성장 율과 세포주기를 trypan blue exclusion assay와 cell cycle analysis를 하였고, cyclin 발현도를 조사하기 위해 Western blot을 시행하였다. 세포내 ATP 합성 수준과 활성산소 생성을 관찰하기 위해서 ATP assay와 2ʹ,7ʹ-dichlorodi- hydrofluorescein diacetate(DCFH-DA), dihydrorhodamine 123(DHR 123)를 이용하여 FACS analysis를 시행했다. 세포내 redox status의 변화는 GSH assay를 시행하여 측정했다.
결과: Complex Ⅱ의 억제제인 TTFA (400 μM)를 Chang 세포에 처리시 세포 성장율이 24시간 이후부터 50% 이하로 현저하게 저하되는 것을 관찰할 수 있었 고, G1/S boundary에 synchronize 시킨 후 세포주기를 분석한 결과 다시 G1으로 돌아올 때까지 걸리는 시간이 18시간(대조군)에서 24시간(TTFA 처리군)으로 지연되는 것을 관찰했고, 이러한 세포주기 진행속도 지연효과는 각 주기에 균일하게 1.6배로 지연됨을 확인하였다. 또한 TTFA 농도 의존적으로 지연됨을 관찰할 수 있었다. TTFA에 의한 세포내 ATP 합성의 변화를 측정한 결과 48시간에서 50% 정도(약 7 pmol/μg lysate)로 감소하는 것을 관찰하였고, 이는 세포주기 지연과는 무관한 것으로 생각되었다. High glucose DMEM 배지를 이용하여 세포내 ATP 수준을 높인 상태에서도 세포지연은 복구되지 않은 것으로 보아 TTFA에 의한 세포주기 지연효과는 ATP 합성의 영향은 아니라는 것을 알 수 있었다. 다른 가능성으로 초기 활성산소 생성에 기인한 것으로 생각하고, DCFH-DA와 DHR 123를 이용하여 TTFA에 의한 활성산소 생성 증가도를 조사하였을 때 5분 부터 증가하여 30분까지 유의하게 증가하는 것을 확인 하였고, 이는 농도 의존적으로 나타남을 확인하였다. 또한 이때 세포내 항산화 단백질인 총 GSH양은 변화가 없지만 GSSG(oxidized GSH)양이 15분 후에 증가하여 48시간까지 계속 증가하는 것을 관찰함으로서, 초기에 생성된 활성산소에 의한 세포내 redox status 변화를 확인할 수 있었다. 이렇게 생성된 활성산소는 trolox, α-tocopherol과 같은 항산화제를 처리함으로서 제거되었지만, 세포주기의 지연은 복구되지 않았다.
결론: 이상의 결과에서 TTFA를 이용하여 Complex Ⅱ의 활성을 억제하였을 때 세포주기를 지연시킴으로서 세포의 성장를이 저하되는 것을 확인하였고, 이러한 현상은 ATP 합성 변화에 의한 영향이 아님을 확인하였다. TTFA가 세포주기를 지연시켰으며, 초기 활성산소를 증가시킴으로서 세포내 redox status의 변화를 초래한 것으로 생각되나, 이에 의한 단독효과가 아니라 아직 밝혀지지 않은 다른 기전이 함께 작용하였을 것으로 생각되었다. 이 결과들로 Complex Ⅱ가 그동안 밝혀진 에너지 합성 관련 작용 이외에 활성산소 생성을 통해 세포성장 조절을 할 것이라는 새로운 작용기전을 제시하게 되었다.
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dc.language.isoko-
dc.titleBiochemical and Cellular Analysis of the Function of Complex Ⅱ in Regulation of Cell Division Cycle-
dc.title.alternativeComplexⅡ가 세포주기에 미치는 영향에 대한 생화학 및 세포생물학적 연구-
dc.typeThesis-
dc.identifier.urlhttp://dcoll.ajou.ac.kr:9080/dcollection/jsp/common/DcLoOrgPer.jsp?sItemId=000000003285-
dc.subject.keywordComplexⅡ-
dc.subject.keywordOxidative phospholylation-
dc.subject.keyword2-thenoyltrifluoroacetone(TTFA)-
dc.subject.keywordReactive oxygen species-
dc.subject.keywordRedox change-
dc.subject.keywordCell cycle-
dc.subject.keywordCellular redox status-
dc.subject.keyword산화적 인산화 과정-
dc.subject.keyword활성산소-
dc.description.degreeMaster-
dc.contributor.department대학원 의학과-
dc.contributor.affiliatedAuthor변, 해옥-
dc.date.awarded2004-
dc.type.localTheses-
dc.citation.date2004-
Appears in Collections:
Theses > School of Medicine / Graduate School of Medicine > Master
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