Critical C-termical Amino Acids of Hepatitis B Virus Core Proteins for HBV Replication

Abstract

B형 간염 바이러스는 Hepadnaviridae Family로써, 크기가 3.2kb인 partieally duplex DNA genome을 가지고 있으며, 4개의 open reading frame (ORF)으로부터 core protein, surface protein, DNA polymerase, X protein을 발현한다. HBV core protein은 183개 또는 185개의 amino acid로 구성되어있는 22kDa의 단백질이며, HBV core protein은 pgRNA 의 encapsidation 및 DNA 합성에 관여하는 것으로 알려져 있다. HBV core protein은 기능적으로 두 부위로 나뉜다. core particle 조립에 관여하는 core protein 의 N-말단부위와 핵산과 결합하는 부위인 C-말단부위로 나뉜다. Core protein의 N-말단부위 (amino acid 1-149)만으로도 core particle을 이루지만 pgRNA 는 encapsidation 을 하지 못한다. 이전 연구는 HBV core protein의 C-말단을 DHBV core protein으로 치환한 다양한 mutant 를 이용한 실험을 하였다. 이들 중에 DHBV core의 242-250번 9개의 amino acid를 HBV core의 167-175번으로 치환한 chimeric core HDHD의 DNA 합성을 확인하였을 때, HBV RC (relaxed circular) DNA를 합성하는 것으로 관찰되었다. Chimeric core protein HD 221-262을 기본으로 하여 HDHD chimeric core protein과 반대로 242-250번의 9개 amino acid를 제외하고 나머지를 HBV core 로 치환한 chimeric core protein HHDH에서는 HD221-262와 유사한 양상인 single strand DNA를 비롯하여 relaxed circular DNA 와 double strand DNA가 합성되고, 그 외에 작은 크기 DNA합성이 관찰되었다. HHDH의 mutant core protein의 DHBV의 부분 (amino acid 243 arginine, alanine, serine, proline, leusine, proline, arginine, serine 251)과 그 부위에 해당하는 HBV 의 부분 (amino acid 168 arginine, arginine, arginine, serine, glutamine, serine, proline, arginine, arginine 176)을 비교 하였을 때 9개의 amino acid 중에 4개의 amino acid (amino acid 168, 171, 174, 175) 가 일치하고 5개의 amino acid (amino acid 169, 170, 172, 173, 176) 가 달랐다. 따라서 본 연구에서는 5개의 amino acid를 하나씩 HBV core protein의 amino acid 로 치환시켜 5개의 새로운 chimeric core protein mutant를 cloning하여 HBV DNA 복제에 어떠한 amino acid가 관여하는지 밝히고자 하였다. HHDH의 DHBV부분의 9개 amino acid 중에 HBV core protein의 amino acid와 다른 5개의 amino acid를 HBV로 다시 치환하기 하는 point mutation 을 실시하기 위해, PCR을 이용하여 site-direted mutagenesis 를 실시하였다. 5개의 DHBV core protein amino acid 중에 첫 번째 amino acid인 alanine 을 arginine 으로 (A169), 두 번째 amino acid는 glycine 에서 arginine 으로 (G170R), 세 번째 amino acid는 proline에서 glutamine으로(P172Q), 네 번째 amino acid는 leusine에서 serine으로 (L173S), 다섯 번 째는 serine을 arginine 으로 (S176R) 전환하는 PCR를 실시하여, 각각 하나씩 전환시킨 mutant로 cloning 하여 새로운 chimeric core protein을 만들었다. 5개의 새로운 chimeric core protein의 HBV DNA 합성을 확인한 결과, G170R 과 S176R chimeric core protein이 각각 HBV wild type과 비슷한 양상으로 HBV DNA를 합성하였다. 결과적으로 HBV DNA replication에 core의 C-말단이 관여 하고, core의 C-말단에서도 G170R 과 S176R 이 HBV DNA replication에 중요한 역할을 한다는 것을 알 수 있었다.