Walnut allergy in Korean children: Analysis of clinically relevant allergenic component and identification of IgE-binding proteins in cooked walnut extract

Abstract

BACKGROUND: Walnuts (WN) are one of the main causes of tree nut allergies. However, the potential value of component resolved diagnosis (CRD) for WN allergy is controversial and the influence of different cooking methods on WN proteins have not been evaluated to date. PURPOSE: This study aimed to evaluate the clinical and immunological features of clinical WN allergy and the usefulness of CRD in young children, together with changes in WN antigenicity caused by common cooking methods. METHODS: In study part A, twenty-nine participants with a history of ingesting WN who were assessed for serum-specific IgE to WN (WN-sIgE) and CRD (ImmunoCAP ISAC 112) at the Department of Pediatrics in Ajou University Hospital were enrolled and their demographic profiles, clinical symptoms, and laboratory findings were evaluated. Further, in study part B, the protein fractions of dry-fried and boiled WN extracts were compared with those of raw WNs using sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE), 2-dimentional gel electrophoresis (2DE) and a proteomic analysis using electrospray ionization (LC-MS). An immunoblotting analysis was conducted to examine IgE reactivity toward raw WNs using serum samples from 6 children with a clinical WN allergy. To determine the processed WN proteins with IgE-binding capacity, a 2D-immunoblotting analysis was performed using the pooled sera of 20 WN-sensitized children. RESULTS: Twenty-eight out of 29 patients had specific immunoglobulin E antibodies to Jug r 1 (Jug r1-sIgE). Receiver-operating characteristic curves demonstrated that the Jug r 1-sIgE level was better for discriminating between children who were clinically allergic and tolerant to WN than the WN-sIgE level. Protein bands from raw WNs were identified at 9, 16, 28, 52, 58 and 64 kDa via SDS-PAGE. The 9-kDa and 16-kDa protein bands were enhanced by boiling, whereas the 52-kDa and 64-kDa bands were considerably diminished. On LC-MS analysis, of the 66 IgE-binding proteins present in raw WNs, 57 were found in dry-fried WNs, but only 4 in boiled WNs. A 2D-immunoblotting result confirmed the presence of different binding patterns among children who consumed cooked WNs. CONCLUSIONS: Jug r 1 is the major component allergen in young children with clinical WN allergy. Though the protein profile of cooked WNs is substantially different from that of raw WNs, 4 proteins, including Jug r 1, remained stable after dry-frying or boiling. Further studies are needed to evaluate the clinical relevance of these findings.

배경: 호두는 최근 국내에서도 가장 중요한 견과류 알레르기로 부상하고 있으나, 전 세계적으로 소아 환자 대상 호두 알레르겐 연구는 거의 없다. 소아 환자에서의 주항원에 대해서는 선행 연구들 간에 차이가 있고, 성분항원분석법의 진단적 가치에 대해서도 논란이 있다. 또한, 조리에 따른 호두 항원성의 변화는 국내에서 연구된 바가 없다. 목적: 본 연구는 임상적으로 호두알레르기를 진단받은 환자의 임상, 면역학적 특성과 성분항원분석법의 진단적 가치와 함께 주항원을 분석하고, 조리에 따른 항원성 변화가 있는지 알고자 하였다. 재료 및 방법: 아주대학교병원 소아청소년과를 내원한 환자를 후향적으로 분석하여, 총 29명의 호두알레르기 환자의 호두 특이 IgE를 수집하고, ImmunoCAP ISAC 112를 이용한 성분항원분석을 추가로 시행하였다. 한편, 국내에서 흔히 사용하는 방법으로 호두를 조리 하여 각각의 조항원을 만들어 SDS-PAGE를 수행하고 2DE 분석하여 단백을 비교하였다. 추가로 LC-MS를 통해, 조리에도 변하지 않는 단백을 분석하였다. 또한 호두 특이 IgE가 0.35 kU/L 이상인 환자 20명의 혈청을 pooling하여 2D-immunoblot을 수행하여 조리법이 다른 호두 항원과 IgE 결합 반응에 차이가 있는지 관찰하였다. 결과: 성분항원분석 결과, 총 29명 중 28명의 환자가 Jug r 1 특이 IgE 양성을 보였고, 임상적으로 호두에 대해 관용이 있는 환자에 비해 알레르기 증상이 있는 환자에서 유의하게 그 농도가 높아 호두 특이 IgE 측정 보다도 증상 유무를 구별함에 있어 나은 진단적 가치를 보였다. 조리법을 달리한 호두 조항원을 이용한 SDS-PAGE 결과 생호두에서 단백대는 분자량 9, 16, 28, 52, 58, 64 kD에서 강하게 관찰되었고 9, 16 kDa 단백대는 삶으면 더 강해지는 반면, 52, 64 kDa 단백대는 희미해짐을 확인하였다. 2DE 결과, 조리법이 다른 호두는 각기 다른 단백 분포를 보였으며 LC-MS 결과, 총 66개의 단백이 생호두에 있었지만 그 중 4개의 단백만이 삶은 호두에서도 관찰되었다. 2Dimmunoglotting 결과 환자 혈청은 조리한 호두에서 생호두와는 다른 IgE 결합을 보였다. 결론: 우리나라 소아 혈청 특이 IgE를 이용한 연구 결과 호두 성분 항원 가운데 Jug r 1이 임상적으로 의미있는 주알레르겐임을 확인하였다. 호두의 알레르기 항원성은 조리법에 따라 변하지만 Jug r 1은 열처리 조리에 의해서도 알레르기 항원성이 소실되지 않고 유지됨을 확인하였다.