Study on the Mitochondrial Enzyme Activity of Senescent Cancer Cells in the Colorectal Cancer

Abstract

Cellular senescence is a state of irreversible growth arrest that can be observed in normal aging and in various diseases. Repeated mitotic activity was initially considered to be a cause of cellular senescence. However, senescence can also be induced by diverse stimuli, such as reactive oxygen species stress, DNA damage, and oncogenic activation. Oncogene-induced senescence can occur after oncogenic activation in primary cells: though, it has been considered a barrier to carcinogenesis. To overcome this barrier in cancer progression, additional oncogenic activation or loss of the tumor suppressor gene is needed. During cellular senescence, cellular metabolism functions differently from that of normal cells. Mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) decreases in cancer cells compared to those of adjacent normal cells. However, the status of OXPHOS and glycolysis in senescent cancer cells is poorly understood. Therefore, the aim of the present study is to investigate the OXPHOS status in senescent cancer cells. In addition, the association between the OXPHOS status in senescent cancer cells and the clinicopathologic parameter of colorectal cancers (CRCs) was evaluated via a senescence-associated β-galactosidase (SA-β-Gal) assay, nicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase-tetrazolium reductase (NADH-TR) stain, and succinate dehydrogenase (SDH) stain in CRC tissues. We also analyzed reactive oxygen species (ROS)-induced CRC cell lines using a 3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay. In addition, we performed nicotinamide phosphoribosyltransferase (NAMPT) quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction (qRT-PCR) on the CRC cell lines and a NAMPT immunohistochemistry (IHC) stain using 24 cases of CRC tissue to investigate the correlation mitochondrial enzyme activity and NAMPT expression. We found that the SA-β-Gal-positive senescent cancer cells in CRCs were associated with increased expressions of NADH-TR and SDH stains, thus indicating increased OXPHOS. We demonstrated increased OXPHOS in senescent cancer cells in vitro using ROS-induced senescent CRC cells. Since increased expression of NADH-TR could be associated with NAMPT, we investigated NAMPT expression in 24 cases of CRC and found that NAMPT expression was significantly associated with the expression of NADH-TR. Furthermore, the expression of NAMPT was associated with lymphatic invasion in the clinicopathological parameters of CRC.

세포노화는 비가역적으로 세포의 분열이 멈춘 상태로 이러한 세포노화는 정상적인 노화뿐만 아니라 다양한 질병에서도 발견될 수 있다. 초기에는 반복된 세포 분열이 세포노화의 원인으로 여겨졌으나 이후 활성산소종 스트레스, DNA의 손상, 암유전자 활성 등 다양한 자극에 의해서도 세포노화가 유도될 수 있다고 알려졌다. 암유전자 유도 노화세포는 일차 세포에서 암유전자를 활성화시키면 발생하며, 암으로의 진행을 막는 장벽 역할을 하는 것으로 알려져 왔다. 이를 극복하고 암으로 진행하려면 추가적인 발암유전자의 활성화나 종양억제유전자의 비활성화가 발생하여야 세포노화가 사라지며 암으로 진행할 수 있다. 그러나 암에서도 노화세포가 발견될 수 있으며 암의 진행과 연관될 수 있다. 세포노화에서 세포의 대사는 정상세포와 다르다. 노화세포에서 산화적인산화 및 일련의 과정이 증가하는 것으로 알려져 있는데, 암세포에서 산화적인산화는 감소해 있다고 알려져 있다. 그러나 암세포에서 관찰되는 노화세포의 산화적인산화의 상태는 불분명하다. 본 연구에서는 암노화세포의 산화적인산화 정도를 대장암 조직 (개수=25) 및 대장암 세포주에서 조사하였다. SA-β-Gal 염색, NADH-TR 염색, SDH 염색을 이용하여 분석하였으며, 암노화세포의 산화적인산화 정도와 임상병리학적 인자들의 연관성을 조사하였다. 또한 세포 단위에서 활성산소종으로부터 촉발된 대장암 노화세포주들을 이용하여 MTT assay 실험을 진행하였으며 추가적으로 NAMPT 효소의 발현을 분석하였다. 실험 결과 대장암에서 SA-β-Gal 양성의 암노화세포가 산화적인산화 증가를 나타내는 NADH-TR 및 SDH 염색 정도의 증가와 관련이 있다는 것을 관찰하였으며, 이를 활성산소종으로 유도된 암노화세포에서 실험적으로 확인하였다. NADH-TR 염색의 증가가 NAMPT와 연관될 수 있기 때문에 대장암 조직에서NAMPT 효소에 대한 조직면역염색을 실시하였고 NAMPT의 발현 정도가 NADH-TR의 염색 정도와 유의하게 연관되어있는 것을 확인할 수 있었다.