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Characterization of anti-DNA antibody with Tat peptide sequence in CDR

Other Title
Tat 펩티드가 삽입된 항-DNA 항체 구조의 생화학적 특성
Authors
정, 종근
Degree
Master (2009)
Abstract
"Tat 펩티드가 삽입된 항-DNA 항체 구조의 생화학적 특성 항-DNA 항체인 3D8 단일 가닥 가변부위 (single chain variable fragment: scFv)는 핵산결합능 및 가수분해활성이 있으며, 3D8 VL 단독부위만으로도 핵산 결합능 및 가수분해능을 발휘한다. 또한 3D8 scFv는 세포막 침투능이 있어서, 세포막을 투과한 후, 세포질에 위치하게 되고, 결국은 세포사멸을 유도한다고 알려져 있다. 본 연구에서는 3D8 scFv의 핵산가수분해 활성은 그대로 유지하면서, 세포막 투과 후 핵으로 이동할 수 있는 3D8 scFv 변이체를, CDR 교체 방법으로, 제작하고자 하였다. 핵으로 이동하는 세포막 침투성 펩티드 (cell penetrating peptides)로서 가장 잘 알려진, 13개 아미노산으로 구성된 Tat 펩티드 (GRKKRRQRRRPPQ)를 3D8 scFv의 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3부위에 교체, 삽입된 scFv 변이체를 클로닝한 후, 단백질을 박테리아세포에서 발현, 정제하였다. 세 종류의 변이체 중에서 수용성 단백질로서의 발현률이 가장 높은 VH-CDR3 부위가 Tat으로 교체된3D8 scFv 변이체 (3D8s-HC3/Tat)의 DNA 결합력, DNA 가수분해능력, 세포내 침투능, 및 핵내로의 이동여부를 조사하였다. ELISA 및 SPR (surface plasmom resonance) 분석에서, 3D8s-HC3/Tat이 3D8 scFv과 유사한 정도의 DNA 결합력을 유지함을, in situ DNA가수분해활성 분석을 통하여 DNA 가수분해활성이 그대로 유지하고 있음을 확인하였다. HeLa 세포에서의 유세포 분석 결과는 3D8s-HC3/Tat 단백질이 3D8 scFv 와 유사한 정도로 세포내로 잘 유입되는 것을 보여주었다. Confocal microscopy 에서는 3D8 scFv이 관찰한 모든 세포의 세포질에서만 검출된 반면, 3D8s-HC3/Tat 는 관찰된 약 40%의 세포에서 세포질과 핵에서 모두 검출되었는데, 이는 Tat 펩티드의 특성에 의한 것이라 생각된다. 이러한 결과들은, 3D8 scFv의 원래 활성을 그대로 유지하면서도, 새로운 특성이 추가된 3D8 scFv 변이체의 생산이, 특정 CDR을 기능성 펩티드로 교체함으로써 가능하다는 것을 보여준다. "
Keywords
Anti-DNA antibody3D8 scFv (Single chain variable fragment)Tat peptidecomplementarity-determining regions (CDRs)cell penetrating peptides (CPPs)
Appears in Collections:
Theses > Graduate School of Biomedical Sciences > Master
AJOU Authors
정종근
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