Effect of TIS21 on DNA Damage Repair Induced by Etoposide

Abstract

TIS21/BTG2/PC3 (12-O-tetradecanoyl phorbol-13-acetate-inducible sequence 21) has been known as a p53 target gene and functions as a tumor suppressor in carcinogenesis of thymus, prostate, kidney, and liver. Although it has been known that the expression of TIS21/BTG2/PC3 was induced during chemotherapy-mediated DNA damage in cancer cells, a role of TIS21/BTG2/PC3 in DNA repair process remains to be elucidated. In this study, the mechanism and role of TIS21 involved in eotposide induced DNA damage signaling were examined. H2AX foci formation, representative marker for DNA damage, was increased in TIS21-/- mouse embryo fibroblasts (MEFs) compared to wild type MEFs. Foci formation of H2AX after etoposide treatment in LacZ infected Huh7 cells were more retained than TIS21 infected Huh7 cells. Comet assay also showed that DNA damage induced by etoposide were smaller in TIS21 expressed cells. In order to examine TIS21 involved in DNA damage repair and apoptosis, immunoblot analysis was performed. The phosphorylation level of Chk2T68 and p53S20 in the present of etoposide in TIS21 infected Huh7 cells (harboring mutant p53) was significantly decreased as compared to LacZ infected cells. In addition to wild type p53 harboring cells such as MCF7, HeLa, and H9C2 cell lines were also confirmed, and it showed same phenomenon with Huh7 cells. Bcl-2-associated X protein (BAX) and p53 upregulated modulator of apoptosis(PUMA), which are known to be pro-apoptotic proteins in p53-dependent apoptosis, were not induced in TIS21 infected Huh7 cells. Caspase 3/7 activity, chromatin condentation and annexin V staining data suggest that TIS21 inhibited Chk2-p53 DNA damage pathway. Furthermore, TIS21 regulated PRMT1 activity and induced hypermethylation of Mre11 protein. In conclusion, TIS21 involved DNA damage signaling and inhibited Chk2-p53 pathway via Mre11 methylation.

TIS21/BTG2/PC3 (12-O-tetradecanoyl phorbol-13-acetate-inducible sequence 21) 은 p53의 타깃 유전자로써 갑상선, 전립선, 신장 및 간에서의 암 발생과정 중에서 암을 억제하는 기능을 하는 것으로 알려져 있다. 또한 암을 치료하기 위한 화학요법에 의해 발생하는 세포사멸 중 TIS21의 발현됨을 관찰함으로써, 세포사멸 과정 중의 TIS21 이 중요시되었다. 이 연구는 암 억제유전자인 TIS21이 etoposide에 의해 일어나는 세포 사멸조절 기작의 관여에 대해 연구하기 위하여 실시되었다. DNA 손상의 마커인 H2AX 의 foci 형성을 wild type MEF와 TIS21-/-mouse embryo fibroblasts(MEFs)에서 관찰 해 본 결과TIS21-/- MEFs에서 H2AX foci 형성되는 세포들이 wild type MEFs보다 더 많이 관찰 되었으며, 이는 TIS21이 DNA 수복 기작에 관여를 한다는 것을 의미하였다. 다음으로 DNA 손상 마커인 single cell electrophoresis 라고 불리는 comet assay 를 시행 하였다. Etoposide를 사용하여 adenovirus LacZ 와 TIS21 이 과발현 된 간암세포주인 Huh7 세포에 DNA 손상을 주었으며, 이때 TIS21 이 과발현 된 세포에서의 comet tail이 더 짧은 것으로 보아, TIS21이 DNA 수선 역할을 할 수 있다는 증거를 관찰하였다. 다음으로 DNA 손상 시그널에TIS21 이 관여하는지를 연구하기 위해, ATM-mediated DNA 수복과 p53-mediated apoptosis에 관여되는 단백질들의 발현과 인산화 정도를 관찰하였다. Chk2의 Thr68 잔기의 인산화는 DNA 손상 후 시그널을 하위로 내려 보내는 중요한 단백질로Ad-TIS21-HA가 과발현된 세포에서 Thr68 잔기의 인산화와 Chk2의 직접적인 하위 시그널인 p53의 Ser20 잔기의 인산화가 Ad-LacZ가 과 발현 된 세포보다 적은 것을 관찰 하였다. p53의 인산화는 단백질의 안정화 및 전사조절에 중요한 역할을 하며, 나아가 세포주기 억제와 세포사멸에 영향을 미치게 된다. Wild type p53을 발현하는MCF7, HeLa, H9C2와 같은 다양한 세포주에서도 동일한 현상을 관찰하여 mutant p53을 가지고 있는 Huh7 에서 관찰되는 Chk2, p53 인산화의 저해가 p53비 의존적으로 관찰됨을 알게 되었다. p53의 Ser20 잔기 인산화의 감소가 세포사멸 기작에 미치는 영향을 연구하기 위해 BAX, p21Waf1/Cip1, NOXA 와 같은 세포사멸에 관계된 단백질 발현을 관찰해본 결과, TIS21이 과발현 세포에서 세포사멸에 관계된 단백질의 발현이 감소 되어있는 것을 관찰하였다. 또한caspase 3/7 활성도 및 annexin V 염색이 TIS21과 발현 세포에서 감소함을 관찰하였다. TIS21은 protein arginine methyltransferase 1(PRMT1) 과 결합을 통하여 PRMT1 의 활성도를 조절한다는 보고를 바탕으로 TIS21 이 과 발현되어있을 때 PRMT1의 기질 중 DNA 수선에 관여하는 Mre11 의 메칠화가 증가하는 것을 관찰 하였다. Mre11 의 과 발현이 또한Chk2의 인산화를 억제하는 것으로 관찰되어 TIS21 이 Mre11의 메칠화를 통해 Chk2 의 인산화에 영향을 미친다는 것을 관찰 하였다. TIS21은 Mre11 과의 결합 및 메칠화를 통해Chk2의 인산화를 억제하는 것으로 보아Chk2-p53를 통한 세포 사멸을 억제하며 DNA 수복에 관여 한다는 결론을 낼 수 있다.