Mechanism on Elongated Mitochondria Formation during Iorn Chelation-Induced Senescent Arrest

Abstract

Enlarged or giant mitochondria have often been documented in aged tissues and several human disease harboring impaired function, although their role and the mechanism involved remain unclear. Recently, we observed progressive changes of mitochondrial morphology to highly elongated form during iron chelation-induced senescence-associated growth arrest of Chang cells. Interestingly, addition of H₂O₂ (200uM) was enough to induce mitochondrial elongation with cellular senescent phenotypes, whereas ethidium bromide (100ng/ml) which was employed to damage mtDNA only reformed cristae structure. TTFA, which is known to complexⅡ inhibitor was induced fragmentation of mitochondria. Elongated giant mitochondria also found in old human diploid fibroblast. Next, we examined expression levels of Drp1 and Mfn proteins, which are known as molecules directly regulating mitochondrial fission and fusion process, respectively. The total cellular expression levels of Drp1 was not significantly changed or decreased, showing diversity of its regulation depending on the stress, whereas expression level of Mfn2 increased in all senescent systems employed. Finally, the increased expression level of Mfn1 and Mfn2 proteins were also observed in the aging process of Sprague-Dawley rats. Taken together, we propose that formation of elongated mitochondria is one of common phenomena developed in the cellular progress to senescence or aging and it might be promoted through ROS production and through enhanced fusion process mediated by a shifted balance of Mfn/Drp1 expression ratio toward Mfn proteins. Additionally, we observed the interaction between Drp1 and GSK3β and also found phosphorylation of Drp1, providing the clue of Drp1 regulation by GSK3β.

목적: 미토콘드리아는 세포가 필요로 하는 대부분의 에너지를 생산하며 또한 환경의 변화나 요구에 따라 자신의 모양, 이동 및 수가 다양하게 변하는 아주 역동적인 세포내 소기관이다. 본 연구에서는 철 이온 흡착제인 Deferoxamine (DFO)으로 유도시킨 세포노화 과정에서 나타난 거대 미토콘드리아의 형성과정을 조사하고, 이와 함께 동반되어 나타나는 여러 가지 미토콘드리아의 기능 이상 중에 어떤 것이 이 현상을 매개하는지를 조사하며, 또한 미토콘드리아 형태 조절인자들로 알려진 Drp1과 Mfn이 이 과정에서 어떻게 작용하는지를 분석함으로써 세포 노화중에 나타나는 거대 미토콘드리아 형성기전을 이해하고자 한다. 방법 및 재료: Deferoxamine에 의해 유도된 세포노화에서 complexⅡ의 기능손상, 활성산소 증가, 미토콘드리아 DNA의 감소현상이 관찰되었기 때문에 이들 손상에 의한 미토콘드리아 형태에 미치는 효과를 알아보기 위해 hydrogen peroxide (H₂O₂), etidium bromide (EtBr), 2-thenoyltrifluoroacetone (TTFA) 를 Chang 세포에 처리 하거나, 미토콘드리아 DNA가 결핍된 ρ^(0)세포주를 구축하여 사용하였고, 전자현미경을 통해서 미토콘드리아 형태를 관찰하였다. 미토콘드리아 형태 조절인자인 Drp1, Mfn1, Mfn2의 발현도를 조사하기 위해 cell lysate 와 SD rat에서 분리한 미토콘드리아에서 Western blot을 시행하였다. Drp1의 조절기전을 알아보기 위하여 Drp1 항체를 이용하여 면역침전을 수행하였고, 이때 GSK3β가 같이 면역침전 되는지를 알아보았다. Drp1의 인산화를 조사하기 위하여 인산화된 잔기를 인지하는 항체로 immunoblotting을 시행하였다. 결과: 농도의 H₂O₂(1mM)를 Chang 세포에 처리하였을 때는 미토콘드리아가 핵 주변에 모이면서 fragmentation되고, 내막이 소실되면서, 세포가 죽어가는 것이 확인되었으나, 저농도의 H₂O₂(200μM)를 처리하여 세포노화가 유도되는 조건에서는 길어지거나 거대한 미토콘드리아 형성이 유도되는 것이 관찰되었다. 그러나 EtBr을 처리하여 미토콘드리아 DNA에 손상을 유도하거나 미토콘드리아 DNA를 완전히 제거시킨 ρ^(0)세포에서는 단지 미토콘드리아들의 내막구조만이 변형된 형태를 갖고 있는 것을 확인하였다. 또한 complexⅡ 억제제인 TTFA를 세포에 처리 하였을 때는 대부분 미토콘드리아의 내막구조가 변형되거나 fragmentation 되는 것을 관찰하였다. 거대 미토콘드리아의 형성은 DFO와 H₂O₂에 의한 세포노화 모델에서 뿐 아니라 primary human diploid fibroblast를 지속적으로 계대 배양하여 노화를 유도시킨 old HDF에서도 관찰 할 수 있었다. DFO로 유도된 세포노화과정에서 미토콘드리아 분열 조절 인자인 Drp1의 총 발현도의 변화는 없었으나 Mfn2는 일시적으로 증가하였고, H₂O₂를 처리한 세포군에서는 Drp1의 발현도 감소와 Mfn1과 Mfn2의 발현도 증가가 동시에 나타났다. 또한 old HDF 세포에서도 Drp1의 발현도 감소와 Mfn2의 발현도 증가가 나타났으며 Mfn1의 발현도에는 변화가 없었다. Mfn1과 Mfn2의 증가는 또한 정상적인 노화과정에 있는 SD rat에서도 관찰하였다. 그러나 EtBr을 처리한 세포군에서는 Drp1과 Mfn2의 발현량에 뚜렷한 변화는 없었다. DFO로 유도시킨 세포노화에서 glycogen의 축적현상이 관찰되었고, 이와 함께 GSK3β의 인산화도 증가하는 것이 관찰 되었다. Chang 세포에서는 정상적으로 Drp1이 GSK3β와 상호작용하는 것을 면역침전법으로 확인하였고, 특히 DFO를 처리한 세포군에서는 Drp1과 상호작용하고 있는 GSK3β의 양이 감소하는 것을 관찰하였다. 또한 Drp1을 면역침전시켜 Drp1의 인산화를 확인하였을 때, tyrosine잔기의 인산화는 DFO처리 하였을 때에도 변화는 없었으나 serine, threonine잔기의 인산화는 감소함이 확인되었다. 결론: 이상의 결과에서 DFO에 의해 유도된 세포노화과정에서 나타난 미토콘드리아의 기능이상 중에서 활성산소 생성 증가가 거대 미토콘드리아 형성을 매개하는 인자임이 확인되었다. 또한 세포가 노화로 진행 될 때 거대 미토콘드리아의 형성은 일반적으로 나타나는 현상임을 알 수 있었다. 이러한 거대 미토콘드리아 형성은 형태조절 인자인 Mfn/Drp1의 발현비율이 Mfn이 증가하는 방향으로의 shifted balance 에 의한 융합과정이 활성화되어 나타나는 것을 생각 되었다. 또한 본 연구에서는 endogenous Drp1의 인산화와 GSK3β와의 상호작용을 확인함으로써 Drp1의 조절 기전을 이해하기 위한 하나의 단서를 제공하였다.