Studies on the Cellular Responses and Roles of Microglia, Astrocytes, and Blood-Derived Inflammatory cells in Injured Rat Brain

Abstract

Brain inflammation is accompanied by brain injury. For several decades, brain inflammation has been considered toxic to the brain. However, recent studies also suggest beneficial roles of inflammation in injured brain. In this study, I analyzed patterns and roles of brain inflammation in injured brain in vivo from the early stage of the injury to have answers to the question whether brain inflammation is harmful and beneficial. In the first part of this study, acute neuronal damage was induced by stereotaxic injection of ATP into the substantia nigra pars compacta (SNpc) and the cortex of the rat brain. ATP acutely caused death of microglia as well as neurons in a similar area within 3 h, and monocytes filled the damaged core after neurons and microglia died. Neither activated microglia nor monocytes expressed iNOS, a major neurotoxic inflammatory mediator. Monocytes rather expressed CD68, a marker of phagocytic activity. Importantly, the total number of dopaminergic neurons in the SNpc at 3 h (~80% of that in the contralateral side) did not decrease further at 7 d. Similarly, in the cortex, ATP-induced neuron-damage area detected at 3 h did not increase for up to 7 d. Thus, the inflammatory responses of microglia and monocytes in response to ATP-induced acute injury may not be neurotoxic. In the second part, I examined behavior and roles of infiltrated monocytes in LPS-injected SNpc. Monocytes vigorously infiltrated at 3 d and thereafter gradually decreased. Some of infiltrated monocytes died, and the remaining monocytes changed morphologically from round to ramified ones. Monocytes exert alternatively activated phenotypes: strong expression of phagocytic activity but negligible expression of pro-inflammatory mediators such as TNF-α, IL-1β and iNOS. Accordingly, recovery of impaired astrocytes, endothelial cells, and neuronal cells occurred after monocytes infiltrated. These results indicate that monocytes play important roles to repair of the injured brain. In the third part, it has been examined how systemic inflammation (SI) affected brain inflammation. After the induction of SI, in the SN region, microglia were morphologically activated, neutrophils infiltrated, and mRNA/protein expression of inflammatory mediators increased within 4-8 h, and subsided within 1-3 days. However, dopaminergic neuronal loss was not detectable for up to 8 d after induction of SI. These results indicate that acute systemic inflammation causes brain inflammation, but this is not sufficiently toxic to induce neuronal injury. Taken together, these results in the three models suggest that brain inflammation functions to isolate damaged sites, remove dead cells and debris, and repair microenvironment of the brain rather than to produce cytotoxic proinflammatory mediators. Therefore, brain inflammation appears to be beneficial rather than detrimental to injured brain.

뇌염증반응은 뇌에 존재하는 microglia에 의해 주도적으로 일어나며 뇌손상을 악화시키는데 주요하게 작용하여 파킨슨병과 같은 퇴행성 뇌질환을 유발한다고 알려져 왔다. 그러나 최근의 연구 결과들로부터 neutrophil이나 monocyte와 같은 혈액 염증세포들이 뇌염증반응에 관여할 가능성과 뇌염증반응이 손상부위의 재생을 도와줄 가능성이 제시되었다. 뇌염증반응이 유해한지 아니면 유익한지에 대한 서로 다른 결과는 in vivo 실험과 in vitro 실험의 차이 또는 결과를 분석하는 시간에 따라 나타날 수 있으므로, 본연구에서는 손상받은 뇌에서 microglia와 neutrophil, monocyte들이 어떻게 작용을 하며, 신경세포 손상에 어떤 영향을 미치는지를 확인하여 뇌염증반응의 유해성과 유익성을 분석하였다. 첫째 과제에서는 쥐의 대뇌피질 (cortex)과 흑질 (substantia nigra)에 ATP를 주입하여 급성뇌손상 모델을 유도하였다. ATP가 주입된 중심부위에서는 신경세포뿐만아니라 microglia가 3시간내에 사멸되었으며, 그 주변지역의 microglia는 형태적으로 활성화되어 손상 부위를 둘러싸는 양상이 확인되었다. 손상 유도후 2일째부터 CD45^(+) monocyte가 손상주변부위로부터 유입되기 시작하여, 7일에 손상부위 전체에 유입되었으며, 14일에 점차로 그 수가 줄어드는 양상을 보였다. 그러나, neutrophil의 유입은 거의 관찰되지 않았다. 흥미롭게도 세포독성인자로 알려진 iNOS의 발현은 손상 유도후 초기 (3 시간)부터 회복시기 (28일)까지 거의 확인되지 않았으며, 그에 반해 식균작용의 표지로 알려진 CD68이 monocytes에서 높게 발현됨을 확인하였다. 더욱 중요한 것은, 손상 후 3시간에 측정한 도파민성신경세포의 수가 7일 후에도 감소를 나타내지 않았다. 이 결과들은 microglia가 손상받은 부위를 격리시키고, 혈액에서 유입된 monocyte는 손상받은 세포와 잔해들을 제거하는 식균작용에 관여하지만 신경세포나 주변조직의 손상을 유도하지 않는다는 것으로 생각할 수 있다. LPS를 흑질에 주입한 두번째 모델에서는, LPS 주입후 1일부터 monocyte의 유입이 시작되어, 3일에 가장 많은 세포가 확인 되었으며, 5-7일이 지나면서 일부가 세포사멸을 일으키고 일부는 microglia의 형태로 분화되었다. Microarray와 RT-PCR, 면역염색 결과, monoyctes는 iNOS 등의 classical activation에 관련된 염증매개물질을 발현하지 않는 대신, alternative activation에 관련된 식균작용에 관여하는 mannose receptor와 lysosomal enzyme들을 발현하였다. 이와 더불어, 도파민성 신경세포의 회복은 확인하지 못하였으나, astrocyte, 혈관내피세포, NeuN^(+) 신경세포, MAP-2^(+) dendrite, myelin의 회복을 확인하였다. 이러한 실험결과는 LPS에 의한 염증반응으로 유입된 monocytes가 손상받은 뇌에서 세포치유와 세포재생에 기여할 가능성을 시사한다. 세번째 모델에서는, 전신성 염증반응이 뇌염증반응을 유도하여 파킨슨병과 같은 퇴행성 뇌질환의 발병의 위험인자가 될 가능성을 조사하였다. LPS를 쥐의 꼬리정맥으로 주입하여 전신성 염증을 유도하면, 대뇌피질, 흑질, 해마 등에서 4-8시간에 micorglia의 형태적인 활성화와 neutrophil의 유입, 염증매개물질의 발현이 증가되었으며, 1-3 일 이내에 진정되었다. 그러나, 전신성 염증 유도후 8일이 지나도 흑질에서 도파민성 신경세포사멸은 확인되지 않았다. 이러한 연구결과는 단기적인 전신성 염증반응이 뇌염증 반응을 유도하지만, 신경세포의 손상을 유도할 정도로 독성이 크지 않음을 의미한다. 이러한 세가지 모델에서의 실험결과는 뇌염증반응이 손상된 뇌조직을 격리시키거나 죽은 세포들을 제거하고 뇌미세환경을 재생시키는 일을 하는 것으로 보아, 유해하기보다는 유익한 작용을 위해 일어난다는 것을 강력하게 시사하고 있다.