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유전자 적중법을 이용한 조건적 LDHB 유전자 삭제 마우스 제작

DC Field Value Language
dc.contributor.author김, 소현-
dc.date.accessioned2011-11-10T01:41:13Z-
dc.date.available2011-11-10T01:41:13Z-
dc.date.issued2011-
dc.identifier.urihttp://repository.ajou.ac.kr/handle/201003/4383-
dc.description.abstractIn general, differentiated cells produce most of the ATP to growth from glucose through metabolism. Normal cells produce 2 ATP by glycolysis in the cytoplasm and convert to 2 pyruvates. Next, this pyruvate produces about 36 ATP by oxidative phosphorylation in the mitochondria. On the other hand, many metastatic cancer cells have altered glycolytic(glucose) metabolism. The lactate released by this altered glycolytic metabolism exported out of cancer cells. Because the tumor environment is highly hypoxic so that cancer cells produce of ATP by glycolysis. Cancer cells uptake glucose much more than normal cells. Because, they use inefficient glycolysis for producing ATP. In cancer cell, expression of gene associated with glycolysis and enzyme about lactate production are increased for activating glycolysis. Recently, Many report presented about that discovered altered glucose metabolism in cancer cells is not passive alteration by change in environment, but important role in normal cells. Lactate dehydrogenase(LDH) is a major enzyme involved in conversion of lactate in glycolysis. There are five LDH isozymes as a result of the five differenct combination that are produced by two subunit(A and B gene). Also, they have different enzymatic activity. The LDH-1 that consist of 4 LDHA complex is most active in LDH activity. But LDH activity is inverse amounts of LDHB. So we want make the condition of increased LDHA activity without LDHB in the cell. In this study, we designed a targeting vector about LDHB gene used by LDHB genome(mouse). And then, this targeting vector insert into the ES cell. Then targeted ES cell inject into blastocyst. As a result, we have got the chimera, LDHB targeted mouse. And now, we have gained the LDHB knockout mouse that generated by mating LDHB targeted mouse and Cre-expressed mouse. We expect that LDHB knockout mouse is used to animal model of research for cancer research and mitochondrial function that involved in cancer cell metabolism.-
dc.description.abstract포도당은 세포의 에너지 생산에 이용되는 주 에너지원으로, 세포 내로 흡수된 후 대사 과정을 통하여 에너지 즉 ATP 생산에 사용된다. 정상세포의 경우 세포 내부로 흡수된 포도당은 세포질(cytoplasm)에서 해당작용(glycolysis)을 통하여 2개의 ATP를 생산하며 pyruvate로 분해되고, 다음으로 생성된 pyruvate는 미토콘드리아 내로 이동하여 산화적 인산화 반응(oxidative phosphorylation)을 통하여 완전히 대사되며 36개의 ATP를 생산한다. 그러나 많은 종류의 암세포들(특히 전이성 암세포들)에서는 이러한 당대사에 변형이 생겨, 해당작용을 통하여 생성된 pyruvate가 미토콘드리아에서 대사되지 못하고 대부분 lactate로 변환되며 NAD+를 생산하여 지속적으로 해당작용이 작동될 수 있게 된다. 이 때 생성된 lactate는 세포 외부로 배출된다. 변형 당대사의 원인으로는 생체 내에서 비대해진 종양조직 내부로 산소의 이동이 어려워 미토콘드리아에 의한 ATP 생산이 제한되므로, 종양조직 내부의 세포들은 glycolysis를 주로 이용하여 ATP를 생산하기 때문인 것으로 알려져 있다. 암세포는 ATP생산에 비효율적인 glycolysis로 에너지를 생산하기 때문에 정상세포에 비하여 훨씬 많은 양의 포도당을 흡수하며, glycolysis에 의하여 축적되는 pyruvate는 미토콘드리아에서 이용되지 못하고 lactate의 형태로 세포 외부로 배출한다. 암세포에서는 glycolysis를 활성화시키기 위하여 관련 유전자들과 lactate 생성 유전자들의 발현이 크게 증가되어 있다. 최근 암세포에서 발견되는 변형 당대사가 암세포 주위의 환경변화에 의한 수동적인 변형이 아니라 오히려 정상세포의 암세포 전환에 중요한 역할을 한다는 주장들이 제기되고 있다. 본 연구에서는 증진된 해당작용이 발암기전에 미치는 영향을 연구하기 위하여 pyruvate로부터 lactate를 생산하는 lactate dehydrogenase의 활성을 증진시킨 유전자 조작 마우스를 제작하고자 하였다. Lactate dehydrogenase는 네 개의 단위체가 모여 활성을 발휘하는 복합체 효소로 lactate dehydrogenase A(LDHA)와 lactate dehydrogenase B(LDHB) 두 단위체의 조합에 의하여 활성에 차이가 있다. 즉 LDHA로만 구성된 복합체의 경우 lactate를 생성하는 활성이 가장 강하고 LDHB의 수가 많아 질수록 lactate를 다시 pyruvate로 전환하는 활성이 강해진다. 그러므로 본 연구에서는 마우스에서 LDHB를 제거함으로써 세포내의 모든 lactate dehydrogenase가 LDHA로 구성되도록 즉, lactate 생성의 활성이 항상 증가되도록 조작하고자 하였다. 본 연구에서는 마우스의 LDHB 게놈을 이용하여 LDHB유전자 적중용 벡터를 제작하였으며, 이를 이용하여 LDHB 유전자를 마우스의 줄기배아세포 (embryonic stem cell)에서 적중하였다. 다음으로 LDHB 가 적중된 마우스 줄기배아세포를 대리모 마우스의 blastocyste에 주입하여 chimera 마우스를 생산하였고, 이 chimera 마우스로부터 LDHB 유전자가 적중된 마우스를 얻을 수 있었다. 현재 LDHB가 적중된 마우스를 Cre 제한효소 발현 마우스와 교배하여 LDHB 유전자가 제거된 마우스를 얻는데 성공하였다. 앞으로 LDHB 유전자가 제거된 마우스는 발암기전 연구를 위한 동물 모델 및 미토콘드리아 활성저하 동물 모델로 유용하게 사용될 것으로 기대된다.-
dc.description.tableofcontents국문요약 i

차례 iv

그림 차례 vi

표 차례 vii

Ⅰ. 서론 1

A. Cell metabolism 1

B. Cancer cell metabolism – Warburg effect 3

C. Lactate dehydrogenase, LDH 7

D. LDHB conditional knockout 10

Ⅱ. 재료 및 방법 13

A. LDH assay 13

1. LDH tissue distribution 13

B. Generation of LDHB conditional knockout mice 13

1. Construction of targeting vector 13

2. ES cell transfection 15

3. ES cell screening 15

4. Injection of ES cells into blastocysts 16

5. Birth and breeding of mosaic mice 16

6. Confirmation of LDHB knockout mice 17

Ⅲ. 결과 18

A. ES cell screening 18

B. Germ-line transmission (LDHB+/neo-loxP) 20

C. Genotyping of LDHB+/neo-loxP, FLP 21

D. Genotyping of LDHB+/loxP 22

E. Genotyping of LDHB knockout mice 23

Ⅳ. 고찰 24

Ⅴ. 결론 25

참고문헌 26

ABSTRACT 31
-
dc.language.isoko-
dc.title유전자 적중법을 이용한 조건적 LDHB 유전자 삭제 마우스 제작-
dc.typeThesis-
dc.identifier.urlhttp://dcoll.ajou.ac.kr:9080/dcollection/jsp/common/DcLoOrgPer.jsp?sItemId=000000011684-
dc.subject.keyword유전자 적중법-
dc.subject.keywordLDHB-
dc.subject.keyword마우스-
dc.description.degreeMaster-
dc.contributor.department대학원 의생명과학과-
dc.contributor.affiliatedAuthor김, 소현-
dc.date.awarded2011-
dc.type.localTheses-
dc.citation.date2011-
dc.embargo.liftdate9999-12-31-
dc.embargo.terms9999-12-31-
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Theses > Graduate School of Biomedical Sciences > Master
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