Regulation of Senescence Phenotypes by TIS21 gene in Huh7 Human Liver Cancer Cells

Abstract

일반적으로 Cellular senescence란 시간이 지나면 자연적으로 세포 증식이 억제되고 세포내 항상성 유지가 어렵게 되는 것을 말한다. 이러한 cellular senescence는 tumour cell에서도 일어나는데 tumour cell에서의 senescence는 그 결과가 tumour-suppression 으로서도 작용하지만 tumour-promotion 으로서도 작용되어질 수 있다고 알려져 있다. 본 연구에서 사용한 유전자인 TIS21은 TPA에 의해 유도되어지는 21번째 sequences로서 anti-proliferative family에 속하는 단백질이다. 이 유전자는 mouse에서는 TIS21(TPA inducible sequences 21), human에서는 BTG2(B-cell translocation gene-2), rat에서는 PC3(pheocromocytoma clone-3)로 존재하는 동등 유전자이다. TIS21는 세포내의 전사 보조 인자, 신경세포 분화인자 및 성장억제인자로서 thymocyte 의 stage-specific expansion 을 매개하는 중요인자이고 조혈모세포 증식억제인자로 보고된 바 있다. 이 외에도TIS21은 암 억제, 세포사멸(Apoptosis), cell cycle 조절인자, DNA 수복 조절인자, transcriptional co-regulator, 배아세포의 분화 기작 조절인자로서의 기능을 가지고 있다. 본 연구에서 주목한 TIS21의 기능은 TIS21이 cell cycle 조절인자들을 조절함으로서 세포의 노화에 관여하고 있다는 점이다. 정상 세포에서 TIS21과 동등유전자인 BTG2가 세포노화를 유도한다는 사실에 기반을 두어 암세포에서의 TIS21의 역할을 규명하고자 본 연구를 진행하게 되었다. 암세포의 세포노화환경을 만들고자 사용한 Doxorubicin은 대표적인 anti-cancer drug로서 DNA 염기서열에 직접적으로 삽입되어 α-helix구조의 변형을 초래하여 DNA damage를 일으킨다고 알려져 있다. Doxorubicin은 농도에 따라 세포노화를 일으키거나 세포사멸을 일으킬 수 있다. 저농도의 Doxorubicin은 세포노화를 유도할 수 있지만 Doxorubicin에 의해 유도되는 노화기전은 아직 정확히 규명되지 않았다. 본 연구에서 간암세포주인 Huh7 에 저농도의 doxorubicin을 이용하여 유도되어진 세포노화현상에 anti-proliferative gene 인 TIS21이 미치는 효과를 확인하였다. Huh7 세포에서 TIS21단독으로는 세포노화 과정에 관여하지만 흥미롭게도 Doxorubicin을 이용해 노화를 유도한 Huh7 간암세포에서는 오히려 Doxorubicin에 의해 유도되어지는 노화를 억제하는 결과를 보여주었다. 이를 몇 가지 대표적인 노화 표지들을 이용하여 실험하였다. 먼저 TIS21을 단독으로 발현시켰을 경우 control에 비해 SA-β-galactosidase 활성도가 미약하게 증가하였고, proliferation이 억제되었으며 , actin filament가 가늘어지고 끊어지는 현상이 관찰되었다. 이와는 반대로 doxorubicin으로 노화를 유도한 간암세포에 TIS21을 과발현 시킨 경우 SA-β-galactosidase 활성도가 떨어졌고, doxorubicin에 의해 유도되어지는 actin filament의 remodeling이 감소하였으며, doxorubicin에 의한 세포 내 활성산소 (ROS)의 발생이 억제되었다. 이러한 결과들을 토대로, TIS21단독으로는 간암세포의 노화에 주된 역할을 하기엔 역부족이지만 간암세포노화과정에 기여하고, anti-cancer drug인 doxorubicin에 의해 유도되어지는 간암세포노화에서 TIS21은 doxorubicin에 의해 유도되어지는 간암세포의 노화를 억제한다고 생각되어진다. 또한 이를 short-hairpin RNA를 이용하여 TIS21의 발현을 Knockdown 시켜 이를 확인하는 단계를 진행 중이다. 이러한 이유로 TIS21 발현에 의한 Huh7 간암세포의 노화 조절을 규명하고자 하였다.