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Regulation of NeuroD/BETA2 by cAMP Dependent Protein Kinase A Signaling pathway

DC Field Value Language
dc.contributor.author조, 인수-
dc.date.accessioned2012-10-26T04:16:39Z-
dc.date.available2012-10-26T04:16:39Z-
dc.date.issued2012-
dc.identifier.urihttp://repository.ajou.ac.kr/handle/201003/7545-
dc.description.abstract세포의 운명을 결정하고 그 기능을 조절하는 것은 세포 특이적 유전자의 발현과 이를 통제하는 전사인자들의 역할에 달려있다. 신경 전사인자인 NeuroD는 대뇌피질, 소뇌, 해마, 망막 신경세포의 분화뿐만 아니라, 췌장의 베타세포 발생 및 인슐린 대사조절에 핵심 역할을 담당한다. 또한 최근 의 연구보고들을 통해 기억/학습, 난청, 당뇨, 소뇌 운동장애와 같은 NeuroD 조절 이상에 의한 여러 질병들과의 연관성이 구체적으로 드러나고 있다. 특히, NeruoD가 다양한 세포들의 고유환경에 의존하여, 세포 특이적으로 기능을 조절 받는다는 사실이 확인되면서, NeuroD의 전사적 조절과정과 번역 후 조절 과정에 대한 관심이 고조되고 있다. 하나의 전사인자 (NeuroD)가 다양한 조직에서 세포 특이적 조절과정을 통해, 서로 다른 표적 유전자를 통제하고, 나아가 세포분화 및 세포기능에 미치는 영향이 다르게 나타난다는 사실은 NeuroD의 세포 특이적 반응을 설명해 줄 수 있는 조절기전이 매우 정교하게 일어나고 있다는 사실을 의미하기 때문이다.

이에 본 연구의 Part 1 에서는 NeuroD와cAMP-PKA경로가 신경세포에서 담당하는 역할의 중요성에 주목하였고, 그 결과 PKA에 의한 NeuroD의 인산화 과정을 최초로 확인하였다. PKA에 의한 NeuroD인산화의 정확한 위치 (T91, S137)를 규명하였고, PKA 매개 NeuroD 인산화가 가지는 세포 생리학적 의미와 그 분자 기전을 제시하였다. PKA에 의한 NeuroD의 인산화 위치는 정제된 NeuroD의 in vitro kinase assay와 Mass spectrometric peptide mapping analysis 방법으로 찾아내었다. 또한 인산화 위치로 알려진 각 아미노산을 돌연변이 시킴으로써 이를 wild type과 비교하여 세포내 기능적 차이를 확인하였다. 그 결과, PKA에 의한 NeuroD S137의 인산화는 NeuroD S274의 ERK매개 인산화를 통해 나타나는Ubiquitination과정을 억제함으로써NeuroD 단백질의 안정성을 증가시키고 그 기능을 장시간 보존시킨다는 사실을 증명하였다. 인산화를 통한 NeuroD 안정화가 가지는 생리학적 중요성을 탐구하기 위해 pS137만을 특이적으로 인지하는 항체를 제작, 순수 분리하였고, 실제 생체내 (in vivo) 에서의 발현 양상을 분석함으로써 해마 신경세포의 발생 및 성숙과정에서 NeuroD의 인산화 과정이 중요하다는 사실을 확인하였다. 나아가 시냅스의 효율이 증가하는 신경세포의 전형적인 특징인 장기기억증강 (LTP, Long-Term Potentiation) 현상의 알려진 또 다른 전사인자 CREB (cAMP response element binding protein)과의 발현패턴을 시간대별로 비교/분석함으로써, NeuroD S137의 인산화가 LTP 현상을 설명할 수 있는 학습과 기억모델의 새로운 세포/분자기전이 될 수 있음을 제시하였다. 본 연구를 통해, 궁극적으로 세포 내 NeuroD의 기능이 보존/유지되는 분자기전을 이해함으로써 NeuroD에 의한 발생학적 질병들을 통제하고 치료하는데 보다 정교하고 예측 가능한 대안을 제시할 수 있을 것으로 전망된다.

Part 2 에서는 베타세포의 발생과 인슐린 발현조절에 기여함이 잘 알려진 NeuroD의 역할을 주목함으로써, cAMP에 의한 일련의 신호전달계가 NeuroD의 활성에 미치는 중요한 영향을 조사하였다. 실제로 NeuroD의 프로모터 서열을 분석하여, cAMP response element (CRE)로 알려진 전사조절 서열 (TGACGTCA)을 확인하였다. NeuroD의 프로모터를 이용한 Luciferase assay 결과, cAMP를 만드는 Adenylyl cyclase의 활성자인 Forskolin에 의해 NeuroD의 발현이 HIT cell 특이적으로 억제되었다. cAMP에 의한 전사억제의 원인은 잘 알려진 CRE 억제인자인 ICER의 발현에 의한 것으로 보이며, 실제로 ICER 의 과발현이 NeuroD의 전사활성을 감소시켰다. 또한 ICER가 직접 NeuroD의 프로모터에 결합하고 있음을 ChIP assay를 통하여 규명하였다. 이러한 결과는 세포생리학적으로 중요한 의미를 가진다. 본 연구 결과를 통해 ICER에 의한 NeuroD의 억제현상을 당뇨가 유발하는 당독성의 분자적 기전으로 제시 할 수 있었는데, 이는 쥐의 췌장으로부터 분리한 islet 세포실험에서 고농도 당조건 세포에서만 ICER의 만성적 증가와 NeuroD의 감소가 관찰되었기 때문이다. 동시에 고농도의 glucose조건에서 배양된 HIT cell에서 cAMP-PKA 신호의 표적으로 잘 알려진 전사활성인자 phospo-CREB의 만성적인 증가가 관찰되었는데, 이것이 hyperglycemia에서 forskolin에 의한 ICER의 과도한 전사를 야기시키는 원인으로 제시되었다. pCREB 만성적 증가의 배후에는 pCREB의 양을 조절하는 것으로 알려진 PP2A의 감소가 확인되었다. 실제로 HIT 세포와 islet 세포 실험에서 고동도 당배양조건의 PP2A 발현은 mRNA, 단백질수준 모두에서 감소되어 있었고, PP2A의 효소활성 역시 감소해 있었다. PP2A의 감소가 당독성이 유발하는 비정상적인 유전자 발현 원인으로 지목됨에 따라 PP2A만을 선택적으로 제거하는 siRNA실험을 통하여 본 연구 결과를 다시 한번 검증하였고, PP2A 과발현 세포주를 이용하여 고농도 당배양조건 HIT 세포의 유전자 발현 회복 또한 확인하였다. 종합하면, 당독성에 의해서 PP2A의 감소가 야기되고 이에 따라 pCREB의 만성적인 증가로 인해 음성피드백 기능을 해야하는 ICER의 발현이 비정상적으로 지속된다. 그 결과, ICER의 표적으로 밝혀진 NeuroD의 발현이 억제됨으로써 Hyperglycemia 상태가 지속되고, 당독성에 의한 병태생리가 악순환되는 경로가 형성된다. 이처럼 본 연구는Hyperglycemia에서 관찰되는 ICER에 의한 NeuroD 억제현상을 통해, 당조건에 의해서도 세포의 생존환경이 변화하고 있다는 사실을 제시한 것이다. 따라서 Hyperglycemia에서 NeuroD의 조직학적 발현 위치와 기능적 변화를 통해, 기존 보고들이 구체적으로 다루지 못했던 당독성이 유발하는 신경병증의 악순환 과정을 논리적으로 잘 설명 할 수 있고, 예방 할 수 있을 것으로 기대된다.
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dc.language.isoen-
dc.titleRegulation of NeuroD/BETA2 by cAMP Dependent Protein Kinase A Signaling pathway-
dc.title.alternativecAMP 의존성 단백질 인산화 효소 A (PKA) 신호 전달 경로에 의한 NeuroD/BETA2의 활성 조절-
dc.typeThesis-
dc.identifier.urlhttp://dcoll.ajou.ac.kr:9080/dcollection/jsp/common/DcLoOrgPer.jsp?sItemId=000000012716-
dc.subject.keywordNeuroD/BETA2-
dc.subject.keywordcAMP의존성 단백질 인산화 효소 A-
dc.subject.keywordCREB-
dc.subject.keywordICER-
dc.subject.keyword단백질 탈인산화 효소-
dc.subject.keyword당독성-
dc.subject.keyword신경병증-
dc.subject.keyword인산화-
dc.subject.keyword유비퀴틴화반응-
dc.subject.keyword신경발생-
dc.description.tableOfContentsTABLE OF CONTENTS



ABSTRACT ⅰ

TABLE OF CONTENTS iii

LIST OF FIGURE vi

LIST OF TABLE x

I. INTRODUCTION 1

A. NeuroD/BETA2 1

B. cAMP-mediated CREB/CREM, ICER pathway 3

C. Protein phosphatase 5

D. Glucose toxicity 6

E. Post-translational modification 7

II. MATERIAL AND METHODS 9

A. Common methods 9

1. Plasmids and site-directed mutagenesis 9

2. Cell culture and transfection 10

3. Reporter gene assay 11

4. Reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR) 12

5. Western blot analysis 12

6. Imunocytochemistry 12

7. Statical analysis 13

B. PART 1 13

1. GST-pull down assay 13

2. in vitro PKA assay 14

3. MASS spectrometry 14

4. Ubiquitination assay 14

5. Isolation of mouse hippocampal neuron 15

6. Purification and characterization of phospo-S137 NeuroD antibody 15

C. PART 2 16

1. Isolation of pancreatic islet cells 16

2. Dithizone (DTZ) staining 17

3. Insulin secretion assay 17

4. SYBR green real-time PCR 18

5. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) assay 19

6. PP2A activity assay 20

7. Preparation of PP2A siRNA and transfection 21

III. RESULTS 22

A. PART 1 22

1. PKA phosphorylates NeuroD N-terminus region both in T91 and S137 28

2. Molecular properties of PKA-mediated NeuroD Phosphorylation 33

3. NeuroD is degraded by the ubiquitin-proteolytic pathway in a pS274 dependent manner 33

4. Dual modification of NeuroD by PKA-mediated phosphorylation

and ERK-mediated ubiquitination 37

5. Physiological relevance of PKA-mediated NeuroD phosphorylation 42

6. Purification and characterization of pS137 NeuroD 46

7. PKA-mediated NeuroD phosphorylation contribute to neuronal maturation in vivo 49

B. PART 2 55

1. Glucose stimulation prolongs ICER expression in hyperglycemic islets 55

2. Excessive activation of CREB prolongs ICER induction 61

3. NeuroD is a target gene of ICER 67

4. Reduced PP2A deregulate CREB signaling in chronic hyperglycemia 76

5. Reduced PP2A is the primary cause of impaired gene expression 82

IV. DISCUSSIONS 86

V. CONCLUTIONS 100

REFERENCES 101

국문요약 111
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dc.description.degreeDoctor-
dc.contributor.affiliatedAuthor조, 인수-
dc.date.awarded2012-
dc.type.localTheses-
dc.citation.date2012-
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