Difference in Viability of CD34+ Cells in Cryopreserved Cord Blood According to Evaluation Methods

Abstract

Background: On performing umbilical cord blood (UCB) transplantation, faster engraftment may lead better clinical outcome. Because transplanted viable cell count in UCB is related to the engraftment, accurate evaluation of viability of CD34+ cells in cryopreserved UCB has clinical implication. We examined the difference in viability of cells in cryopreserved UCB according to the duration of cryopreservation and different methods. Methods: A total of 60 UCB samples which were cryopreserved for 1 to 4 years were used in this study. Viability of cryopreserved cells were examined with trypan blue exclusion assay, DNA contents analysis, caspase-3 activation test, intracellular esterase activity and Annexin-V/PI staining. Results: After thawing the cryopreserved UCB, 89% of the total MNCs and 84% of CD34+ cells were viable as identified by trypan blue exclusion assay. In the CD34+ cell population, the cell death rate was found to be 47% by Annexin-V/PI staining and less than 5% by DNA contents analysis. However, cspase-3 activity failed to document apoptosis. The intracellular esterase activity test also showed a cell death rate of about 10∼20% at 2, 4, and 6 hours after thawing. Conclusion: Viable cells in UCB should be measured by several compensatory techniques rather than a single method. Discordance among Annexin-V/PI staining versus trypan blue exclusion, DNA contents analysis, and the caspase-3 activation test or intracellular esterase activity should be clarified in order to apply these techniques for actual cord blood transplantation.

배경: 제대혈 이식에 있어서 신속한 생착이 더 나은 임상 결과를 가져온다. 제대혈 내의 이식된 생존세포의 수는 생착과 관계가 있으므로 냉동 보관된 제대혈에서 CD34+ 세포의 생존능을 정확히 평가하는 것은 임상적으로 중요하다. 저자 등은 냉동보관 된 제대혈에서 냉동보관기간과 측정방법에 따른 세포생존능을 측정하였다. 방법: 본 연구에서는 1∼4년간 냉동보관 되었던 60예의 제대혈을 사용하였다. Trypan blue, DNA 함량 분석, caspase-3 활성 조사, 세포내 esterase 활성도, annexin-V/PI 염색을 통해 냉동 보관되었던 제대혈 내 생존세포를 조사하였다. 결과: Trypan blue 배재 분석을 통해 확인된 바로는 해동 후에 89%의 MNC와 84%의 CD34 양성세포가 생존하였다. CD34 양성세포 중에서는 세포 사멸율이 annexin-V/PI 염색에서는 47%, DNA 함량 분석에서는 5% 미만이었다. Caspase-3 활성화가 거의 관찰되지 않았고, 세포내 esterase 활성도 측정에서 해동 후 2, 4, 6시간에 약 10∼20%의 세포사멸을 보여주었다. 결론: 제대혈 내의 생존세포의 측정은 하나의 방법보다는 몇 개의 상호보완적인 방법들로 측정되어야 한다. Annexin-V/PI 염색과 trypan blue, DNA 함량 분석, caspase-3 활성 조사, 세포내 esterase 활성도 간의 검사결과의 불일치를 볼 때 추후 제대혈 이식의 임상결과들과의 상호분석이 필요할 것으로 생각한다.