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oai:repository.ajou.ac.kr:201003/22612024-10-11T02:17:36Zcom_201003_14372com_201003_14368col_201003_14373

Regulation of TIM-3 Expression in Mast cells and Monocytes 비만세포와 단핵구에서 TIM-3 발현의 조절 신, 동철 박, 선 대학원 의생명과학과 200724295 신, 동철 T cell immunoglobulin mucin-3 (TIM-3) Mast cell Transcription regulation mitogen-activated protein kinase (MAPK) GATA-1 TGF-beta T cell immunoglobulin mucin domain 3 (TIM-3) which is a type-I membrane protein, is expressed on differentiated Th1 cell, mast cell and monocyte. Although expression of TIM-3 and its ligand galectin-9 has been demonstrated in mast cells, the transcriptional regulation of these molecules has not been well explored. Considering the emerging role of mast cells in host defense, I studied the effect of various cytokines, a TLR agonist or FcεR stimulation on transcription levels of TIM-3 and galectin-9 in a human mast cell line, HMC-1 cells. TIM-3 transcription in HMC-1 cell was upregulated only by TGF-b but not by IFN-a, IFN-l, TNF-a, IL-10, LPS or FcεR cross-linking. Whereas transcription of TIM-3 ligand, galectin-9 was not affected by treatment with TGF-b. To reveal downstream pathway of TGF-b stimulation involved in TIM-3 upregulation in HMC-1 cells, I examined MAPK pathway and the role of GATA-1. I demonstrated that TGF-b mediated TIM-3 upregulation was inhibited both by a inhibitor of ERK but not by inhibitors of p38 and JNK. Further, overexpression of GATA-1 did not affect TIM-3 expression in HMC-1 cells. These results suggest that TIM-3 transcription in mast cells may be upregulated by TGF-b through ERK MAP kinase signal. "TABLE OF CONTENTS ABSTRACT ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• i TABLE OF CONTENTS ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• ii LIST OF FIGURES •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• iv I. INTRODUCTION •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 1 A. Function of mast cells ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 1 B. T cell immunoglobulin mucin domain 3 ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 2 C. The role of TGF-b in mast cells •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 3 D. Mitogen-activated protein kinase-dependent, smad-indefendent, signal pathway by TGF-b•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 3 E. The role of GATA transcription factors in mast cells •••••••••••••••••••••••••••••••••• 4 F. Purposes of this research •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••5 II. MATERIALS AND METHODS •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 6 A. MATERIALS •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 7 B. METHODS ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 7 1. Cell culture •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 7 2. Total RNA preparation and cDNA synthesis •••••••••••••••••••••••••••••••••••• 7 3. Semi-quantitative reverse transcription – polymerase chain reaction ••••••••• 8 4. Real-time PCR ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 9 5. Reverse transcription- polymerase chain reaction (RT-PCR) ••••••••••••••••••••• 10 6. IgE sensitization and Intracellular Ca2+ mobilization •••••••••••••••••••••••••• 11 7. Transfection of plasmids •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 11 8. SDS-PAGE and Western blotting ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 12 9. Statistical Analysis •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 13 III. RESULTS ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 14 A. TIM-3 transcription was differently regulated in HMC-1 cells and THP-1 cells • •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 14 B. TIM-3 transcription was not affected by LPS stimulationin HMC-1 cells •••••••••• 17 C. TIM-3 transcription was not changed by FceR stimulation in HMC-1 cells ••• 19 D. TGF-b did not change expression of TIM-3 ligand, galectin-9 in HMC-1 cells •••21 E. TIM-3 transcription was regulated through ERK MAP kinase pathway in TGF-b stimulated HMC-1 cells ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 22 F. GATA-1 transcription factor did not affect TIM-3 transcription in HMC-1 cells ••• 24 IV. DISCUSSION ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 26 V. CONCLUSIONS •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 30 REFERENCES •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 31 국문요약 ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 39 LIST OF FIGURES Fig. 1. TIM-3 transcription was increased in HMC-1 cells stimulated with TGF-b and in THP-1 cells stimulated with LPS respectively •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 15 Fig. 2. High concentration of LPS did not affect TIM-3 transcription level in HMC-1 cell •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 18 Fig. 3. TIM-3 transcription was not increased via Fce receptor signal in HMC-1 cells •• 21 Fig. 4. Transcription of galectin-9, a TIM-3 ligand, was not induced by TGF-b treatment. •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 22 Fig. 5. The increased TIM-3 transcription induced by TGF-b was attenuated by inhibition of ERK MAP kinase •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 24 Fig. 6. TIM-3 transcription was not upregulated by GATA-1 transcription factor ••••••••• 26 " Master 2011-04-13T05:20:40Z 2011-04-13T05:20:40Z 2009 2009 Thesis Theses http://repository.ajou.ac.kr/handle/201003/2261 http://dcoll.ajou.ac.kr:9080/dcollection/jsp/common/DcLoOrgPer.jsp?sItemId=000000009546 000000009546 en