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Regulation Mechanisms of TIM-3 expression in Jurkat T cells and HMC-1 cells Jurkat T 세포와 HMC-1 세포에서 TIM-3 발현 조절 기전 윤, 수진 박, 선 대학원 의생명과학과 107405 윤, 수진 TIM-3 promoter SMAD MEK Jurkat T cells HMC-1 cells T cell/transmembrane, immunoglobulin, and mucin domain-3(TIM-3)는 TIM family에 속하는 분자로 마우스 Th1 세포에 특이적인 세포 막 단백질로 처음 발견되었다. 이 분자는 T 세포와 비만세포 이외에도 대식세포, 수지상세포 등 면역에 관여하는 다양한 세포에서도 발현된다고 알려져 있다. 현재까지 TIM-3가 면역 반응에서 중요한 기능을 한다는 보고가 많이 되고 있는 반면 TIM-3 발현 조절 기작에 대해서는 많이 밝혀지지 않았다. 본 연구에서는 T 세포주와 비만 세포주에서 TIM-3의 발현 조절 기작을 밝히기 위해 다양한 inhibitor들을 사용한 결과 Jurkat T 세포와 인간 CD4+ T 세포에서는 MEK 경로, HMC-1 세포에서는 MEK 경로와 SMAD 의존적 경로가 TIM-3 발현에 중요하게 작용함을 밝혔다. 또한 T 세포에서 TIM-3 발현 조절에 중요하게 작용하는 promoter 부분을 찾기 위해 다양한 길이의 TIM-3 promoter를 포함하는 luciferase reporter vector를 제작하여 luciferase 활성도를 측정하였다. 그 결과 TIM-3 promoter -892/-870과 -144/-121 부분이 자극에 의한 TIM-3 발현 조절에 중요함을 밝혔다. 또한 전사 인자인 AP-1과 NF-κB가 TIM-3 발현 조절에 관여할 가능성을 제시하였다. 본 연구의 결과는 면역 반응에서 중요하게 작용하는 TIM-3의 발현 조절 신호 전달 경로와 promoter 부분을 밝힘으로써 TIM-3 발현 조절 기작을 이해하는데 기초를 제공할 것이다. Ⅰ. 서론 1 Ⅱ. 재료 및 방법 5 A. 세포배양과 CD4+ T 세포의 분리 5 B. RNA 추출과 real-time RT-PCR 6 C. Luciferase reporter vector 제작 7 D. Cell Transfection 9 E. Luciferase reporter assay 9 F. inhibitor 실험 10 G. SDS-PAGE 와 Western blotting 10 H. 세포 sorting 11 Ⅲ. 결과 12 A. 세포 활성에 의한 TIM-3 mRNA 발현 증가 12 B. MAPK 경로에 의한 TIM-3 전사 조절 16 C. Jurkat T 세포에서 TIM-3 promoter 활성에 대한 MEK의 영향 24 D. Jurkat T 세포에서 TIM-3 발현에 중요한 promoter 부분 분석 27 E. TIM-3 발현에 관여하는 전사 인자의 탐색 31 F. HMC-1 세포에서 smad 의존적 경로를 통한 TIM-3 전사 조절 36 Ⅳ. 고찰 38 Ⅴ. 결론 43 참고문헌 44 ABSTRACT 48 그 림 차 례 Fig. 1. TIM-3 mRNA was increased in Jurkat T cells and HMC-1 cells stimulated with PMA and TGF-β, respectively 14 Fig. 2. The induction of TIM-3 mRNA was attenuated by MEK inhibitors in cell lines 19 Fig. 3. ERK was phosphorylated in Jurkat T cells by PMA stimulation, but not in HMC-1 cells by TGF-β stimulation 21 Fig. 4. The induction of TIM-3 mRNA was attenuated by MEK inhibitors in human CD4+ T cells 22 Fig. 5. TIM-3 mRNA expression was increased in Jurkat T cells by MEK-2 overexpression at the early time point 23 Fig. 6. The TIM-3 promoter activity was reduced by MEK inihibitors in Jurkat T cells 25 Fig. 7. PMA-responsive region in TIM-3 promoter 29 Fig. 8. The implication of AP-1 site within T3U(0.35) region in TIM- 3 promoter activity 33 Fig. 9. The role of NF-κB involved in PMA-induced TIM-3 expression 34 Fig. 10. The induction of TIM-3 mRNA by TGF-β stimulation was attenuated by smad inhibitor in HMC-1 cells 37 표 차 례 Table 1. primer for amplification of TIM-3 promoter 8 Master 2011-11-07T02:22:36Z 2011-11-07T02:22:36Z 2011 2011 Thesis Theses http://repository.ajou.ac.kr/handle/201003/4359 http://dcoll.ajou.ac.kr:9080/dcollection/jsp/common/DcLoOrgPer.jsp?sItemId=000000011461 000000011461 ko