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초파리 생체시계에서 CLOCK의 PERIOD 결합 도메인의 역할 강, 두현 김, 은영 대학원 의생명과학과 201024354 강, 두현 초파리 생체시계 전사활성 결합도메인 dCLOCK dPERIOD 생체시계의 작동 기전은 Transcriptional/Translational Feeldback Loop (TTFL)이다. 초파리에서는 전사인자인 CLOCK (dCLK)과 CYCLE (CYC)가 결합하여 period (per)와 timeless (tim)의 발현을 촉진하고, PER와 TIM 단백질은 결합하여 CLK/CYC의 활성을 억제함으로써 자신의 발현을 저해하며 하는 되먹임 고리가 TTFL의 핵심 고리를 이룬다. PER/TIM 이합체에서 PER가 CLK/CYC의 활성을 억제하는 역할을 하는데 어떤 생화학적 기전을 통하여 억제하는가에 대한 이해가 많이 부족하다. 본 연구에서는 CLK의 아미노산을 각각 100~200개 정도의 단위로 내부적으로 제거하여 변이체를 만들고 PER가 결합하는 도메인을 찾고자 하였다. Schneider2 (S2) 초파리 세포라인에서 각각의 CLK 변이체들과 PER와의 결합정도를 면역 침강법으로 비교한 결과 아미노산 657-707 이 제거된 dCLK (dCLK657-707로 명명)이 PER와 결합 정도가 감소하는 것을 관찰하였다. 흥미롭게도 S2세포 에서 CLK657-707은 E-box 의존적인 전사활성을 나타내지 못하였다. 그러나 dCLK657-707이 CYC단백질과는 정상적으로 결합하는 것으로 보아 아미노산 657-707의 제거로 인한 구조 변화와 같은 비특이적 결함에 의해서가 아니라 아미노산 657-707 부위가 dCLK단백질의 전사활성 및 PER 단백질과의 결합에 필요한 도메인임을 의미하는 것이다. 아미노산 657-707의 in vivo 역할을 탐색하기 위하여 dCLK△657-707을 발현시키는 초파리를 제작하고 dCLK을 발현하지 못하는 ClkOUT 유전적 배경 (dClk△657-707 ; ClkOUT 으로 명명)에서 분자적•행동학적 리듬을 관찰하였다. dClk△657-707; ClkOUT 초파리는 생체리듬을 나타내지 못하여 초파리 세포라인에서 얻은 결과와 마찬가지로 아미노산 657-707 부위가 CLK이 생체시계를 작동시키는 데 있어 중요한 역할을 하는 도메인임을 입증할 수 있었다. 흥미롭게도 S2 에서 dCLK△657-707은 전사활성을 전혀 나타내지 못하였는데, 초파리에서는 PER와 TIM 단백질이 정상 초파리에서 보다는 약간 낮은 정도로 만들어지는 것으로 확인되어 이에 대한 후속 연구가 진행되어야 할 것으로 보인다. 국문요약 iv 차례 vi 그림차례 viii 표차례 x Ⅰ. 서론 1 Ⅱ. 재료 및 방법 4 A. plasmid 4 1. S2에서 발현시키기 위한 plasmid 들 4 (1) plasmid 종류 4 (2) Site-directed mutagenesis를 위한 primer 4 (3) Site-directed mutagenesis 6 2. 형질전환 초파리 제작을 위한 plasmid 8 B. Schneider 2 (S2) 세포의 배양과 transfection 9 C. 형질전환 초파리 (Transgenic Drosophila melanogaster) 10 D. Locomotor activity assays 11 E. Immunoblot analysis 12 F. Immunoprecipitation(IP) 15 G. Luciferase Reporter Assay 와 β-Galactosidase Enzyme Assay System 18 H. Quantitative Real-time RT-PCR 20 Ⅲ. 결과 21 A. S2 세포에서 dCLK(△579-778) 은 dPER 가 결합 하지 못하지만 CYC 단백질의 결합에는 영향이 없다. 21 B. S2 세포에서 dCLK(△657-707)은 dPER와의 결합을 하지 못한다. 25 C. dCLK(△657-707) 을 발현하는 형질전환 초파리는 정상적인 생체 리듬을 가지지 못한다. 29 Ⅳ. 고찰 38 Ⅴ. 결론 40 참고문헌 42 ABSTRACT 46 Master 2012-10-26T04:09:32Z 2012-10-26T04:09:32Z 2012 2012 Thesis Theses http://repository.ajou.ac.kr/handle/201003/7543 http://dcoll.ajou.ac.kr:9080/dcollection/jsp/common/DcLoOrgPer.jsp?sItemId=000000012686 000000012686 ko