Genistein-Induced Potentiation Effect on Glucose-Stimulated Insulin Secretion (GSIS) in INS-1 β-cells

Abstract

Impaired secretion of insulin as well as insulin resistance is a critical characteristic of type 2 diabetes. Thus, correction of the deficient secretion of insulin as well as improvement of insulin action is an important target for prevention of overt type 2 diabetes. Sulfonylureas have been used to stimulate insulin secretion in patients with type 2 diabetes. However, glucose-dependent insulinotropic molecules are required to improve diabetic hyperglycemia since sulfonylureas have glucose-independent insulinotropic effect, possibly eliciting hypoglycemia, and, moreover, are cytotoxic to beta cells under long-term exposure. Genistein, a isoflavonoid phytoestrogen isolated from soy bean seed and having tyrosin kinase inhibition activity, had a potentiation effect on GSIS (glucose-stimulated insulin secretion) in pancreatic INS-1 beta cells. Although the potentiation effect was glucose-dependent, the signal involved in potentiation effect were not intensively studied. First, to determine whether genistein has the same potentiation effect on other insulinotropic agents, potentiation effect by genistein on other insulinotropic agent-induced insulin secretion were investigated. Gesnistein had similar potentiation effect on insulin secretion by nutrients such as L-leucineLl-glutamin (Leu/Gln) and pyruvate, but little potetiation effects by simple calcium influx enhancer such as tolbutamide, KCl, and Bay K8644, suggesting that genistein may augment amplifying signals involved in insulin secretion. On the other hand, glimepiride-induced insulin secretion coulde be potentiated by genistein, suggesting that glimepiride is able to elicit another signal as well as calcium influx. Second, to determine which amplifying signals such as protein kinase A (PKA), protein kinase C (PKC) and Ca2+/Calmodulin kinase Ⅱ (CaMK II) on insulin secretion were invastigated using of pharmacological inhibitors. Studies showed that CaMK II inhibitor reduced genistein-induced potentiation effect on insulin secretion, while inhibitors of PKA and PKC did not reduce. Immunoblotting studies also demonstrated that genistien significantly enhanced phospho-CaMK II level elicited by Leu/Gln and glimepireide. whereas the same treatment did not enhance phosphorylation of PKA and PKC substrates. Third, to determine whether calcium is involved in genistein-induced CaMK II phosphorylation, we measured intracellular Ca2+ level after genistein treatment. Intracellular Ca2+ level was futhermore increased by genistein and glimepiride. Fourth, to determine whether potentiation effect of genistein-induced insulin secretion was due to phytoestrogen activity or tyrosine kinase inhibitor activity, studies of using 17β-estadiol (astrogen receptor agonist), tyrphostin25. 17β-estadiol did not potentiation effect on insulin secretion. Tyrphostin25 as other tyrosine kinase inhibitor had potentiation effect on insulin secretion by Leu/Gln, but did not potentiate effect on insulin secretion by glimepireide, suggesting that genistein may not potentiate insulin secretion by another activity instead of phytoestrogen activity and tyrosine kinase inhibitor activity. Last, over-expression CaMK Ⅱ more incresed genistein-induced potentiation effect on insulin secretion and CaMK Ⅱ activation. In conclusion, our studies suggest that geniistein potentiates insulin secretion by calcium-mediated augmentation of CaMK II activation.

제2형 당뇨병의 특징은 인슐린 분비 이상과 인슐린 저항성이다. 인슐린 분비 이상의 교정과 인슐린 작용의 개선은 제2형 당뇨병의 치료에서 중요하다. surfonylurea는 과거부터 제2형 당뇨병 환자에서 인슐린 분비를 촉진하는 약제로 사용되어 왔지만 포도당 비의존적 약물로서 저혈당 (hypoglycemia)에 빠질 위험이 있으며, 오랜 기간 노출될 경우 베타 세포에 독성을 나타낸다. 그러므로 포도당 의존적 인슐린 분비 약제의 개발이 필요하다. Genistein은 콩과식물 씨앗에서 분리된 물질로써 식물성 estrogen 기능과 tyrosine kinase를 억제하는 기능뿐만 아니라 동물 모델에서 인슐린 분비를 항진하는 효과를 가지고 있다. Genistein이 pancreatic INS-1 베타 세포에서 포도당 의존적으로 인슐린 분비를 항진하는 사실은 이미 보고되었지만 인슐린 분비 항진에 관여하는 신호 전달 기작에 대해서는 명확하게 밝혀지지 않았다. 그러므로 본 연구에서는 genistein에 의해 항진되는 인슐린 분비 기작을 밝히고자 한다. 첫 번째로 genistein에 의한 인슐린 분비 항진 효과가 다른 인슐린 분비 촉진 물질에도 있는지 조사하였다. L-leucine/L-glutamine (Leu/Gln), pyruvate와 같은 영양분에 의한 인슐린 분비에서 genistein에 의한 분비 항진 현상이 나타났으며, tolbutamide, KCl, Bay K8644와 같이 단순히 Ca^(2+) 유입의 증가만을 유발하는 약제에서는 genistein에 의한 인슐린 분비 항진 현상이 나타나지 않았다. 따라서 genistein은 인슐린 분비를 유발하는 triggering pathway 단계보다는 인슐린 분비를 강화시켜주는 amplifying pathway를 증가시킬 것으로 생각된다. 또한, genistein은 surfonylura로 알려진 glimepiride에 의해 유도되는 인슐린 분비를 항진시켰다. Triggering pathway를 올려준다고 알려진 glimepiride는 Ca^(2+) 유입 외에도 다른 신호를 통해 인슐린 분비를 항진할 것으로 생각된다. 두 번째로 인슐린 분비에 관여하는 대표적인 amplifying pathway 신호 protein kinase A (PKA), protein kinase (PKC), Ca^(2+)/Calmodulin kinase Ⅱ (CaMK Ⅱ)와 genistein과의 연관성을 알아보고자 저해제 (Pharmacological inhibitor)를 사용하여 연구를 수행하였다. CaMK Ⅱ 저해제들은 genistein에 의한 인슐린 분비 항진 현상을 감소시키는 반면 PKA, PKC 저해제들은 genistein에 의한 인슐린 분비 항진 현상을 감소시키지 않았다. Immunoblotting 실험에서 genistein에 의해 CaMK Ⅱ의 활성이 증가했지만 PKA, PKC는 활성이 증가되지 않는 결과를 얻었다. 세 번째로 genistein에 의해 유도되는 CaMK Ⅱ의 활성에 Ca^(2+) 의 영향을 조사하기 위해 genistein을 처리하고 세포 내 Ca^(2+) 양을 조사해 보았다. Genistein을 처리하면 Leu/Gln, glimepiride에 의해 유도되는 세포 내 Ca^(2+) 양이 더욱 증가 되었다. 네 번째로 genistein에 의한 인슐린 분비 항진 효과가 genistein이 가지는 식물성 estrogen 기능 또는 tyrosine kinase을 억제하는 기능 때문인지를 알고자 β-estradiol과 tyrosine kinase 억제 기능을 가진 다른 약제 tyrphostin 25를 사용하여 실험을 수행하였다. β-estradiol을 처리 하였을 때 인슐린 분비가 더 항진되는 효과는 나타나지 않았다. Tyrphostin 25를 처리하였을 때 genistein과 마찬가지로 Leu/Gln에 의한 인슐린 분비 항진 효과는 나타났지만 glimepiride에 의한 인슐린 분비 항진 효과는 나타나지 않았다. 그러므로 genistein에 의한 인슐린 분비 항진 효과는 tyrosine kinase를 억제하는 기능이 아닌 다른 활성에 의해서 항진되었을 것으로 생각된다. 마지막으로 CaMK Ⅱ를 과발현시킨 세포를 이용한 실험에서 CaMK Ⅱ를 과발현시키면 genistein에 의한 인슐린 분비 항진 현상이 더욱 증가하였으며 CaMK Ⅱ 활성 또한 증가하였다. 결론적으로 genistein은 Ca^(2+) 매개 CaMK Ⅱ 활성을 통해 인슐린 분비를 항진시키며 genistein은 포도당 의존적 인슐린 분비 항진 제로서 당뇨병 치료에 기여 할 수 있을 것이다.